Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞簡介

Bend.3，小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。由哥倫比亞大學(xué)實驗室從患有內(nèi)皮瘤的BALB/c小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞提取的細(xì)胞系，通過表達(dá)多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染原代細(xì)胞實現(xiàn)了永生化。注射到小鼠體內(nèi)可導(dǎo)致血管瘤形成。

經(jīng)檢測，Bend.3細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮特異性蛋白如PECAM-1、Endoglin、MECA-32和Flk-1，使用炎性細(xì)胞因子如TNFα、IL-1和LPS可誘導(dǎo)蛋白ICAM-1、VCAM-1和CD62E的表達(dá)，并具有濃度和時間依賴性。同時檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可表達(dá)血管假性血友病因子，攝取熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白(LDL)。

這些結(jié)果證實了Bend.3的內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)。Bend.3細(xì)胞在神經(jīng)科學(xué)方面的應(yīng)用較為廣泛，可以作為研究神經(jīng)元遷移、神經(jīng)元分化以及神經(jīng)細(xì)胞毒性等問題的有力工具。此外，Bend.3細(xì)胞也被用于研究失眠、阿爾茲海默癥、霍奇金病等神經(jīng)退行性疾病，以及某些腦腫瘤的治療策略和靶向藥物的研發(fā)。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞用表達(dá)多瘤病毒中T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行轉(zhuǎn)化。觀察到血管性血友病因子的表達(dá)及對熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白(LDL)的攝入確認(rèn)其內(nèi)皮細(xì)胞特性。bEnd.3 cells細(xì)胞可用細(xì)胞因子和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的Peyer's結(jié)高內(nèi)皮細(xì)胞受體，粘膜血管定居因子(MAdCAM-1) 及內(nèi)皮細(xì)胞選擇素的表達(dá)。腫瘤壞死因子 a (TNF alpha), 白介素 1 (IL-1)或 LPS的誘導(dǎo)作用是濃度及時間依賴的。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)特征

Bend.3為內(nèi)皮細(xì)胞樣，貼壁生長。部分細(xì)胞形態(tài)不一致，可能出現(xiàn)扁平狀、上皮樣，或者成纖維細(xì)胞樣被拉長的細(xì)胞。大部分細(xì)胞貼在中間，當(dāng)密度增高時，細(xì)胞形成一個更均勻的單分子層，并以漩渦狀排列。與其他常被描述為鵝卵石樣的內(nèi)皮細(xì)胞相比，Bend.3細(xì)胞更加細(xì)長，有點像成纖維細(xì)胞。

Bend.3細(xì)胞生長過程中的細(xì)胞可能呈顆粒狀，并產(chǎn)生碎片，同時也可產(chǎn)生大量活的漂浮細(xì)胞，因此培養(yǎng)過程中建議不要丟棄漂浮的細(xì)胞。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：Bend.3，小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞

細(xì)胞別稱：bEND.3; b.End3; Bend.3; bEnd3; brain-derived Endothelial cells.3;小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞

種屬來源：BALB/c

年齡性別：6周齡

組織來源：腦微血管

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-2299 BCRC; 60515 ECACC; 96091929

培養(yǎng)基：90%DMEM+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

倍增時間：~26-30小時

抗原表達(dá)情況：ICAM-1 +; VCAM-1 +; MAdCAM-1 +

基因表達(dá)情況：von Willebrand factor,ICAM-1 +; VCAM-1 +; MAdCAM-1 +,The endothelial nature of these cells was confirmed by the observed expression of von Willebrand factor and uptake of fluorescently labeled low density lipoprotein (LDL).,The expression of Peyer's Patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin (MAdCAM-1) and E-selectin can be induced on bEnd

bend3細(xì)胞怎么培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

Bend.3內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇操作

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)的Bend.3細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將BEND.3細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定BEND.3細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

BEND.3細(xì)胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出Bend.3細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個BEND.3細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對Bend.3細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

將裝有Bend.3細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

確定Bend.3細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

BEND.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代小貼士

1. Bend.3細(xì)胞培養(yǎng)過程中形態(tài)多樣，低密度時容易出現(xiàn)放射狀細(xì)胞，看似已經(jīng)鋪滿瓶底，其實細(xì)胞量較少，需要細(xì)胞胞體排列緊密的時候進(jìn)行傳代;

2. 培養(yǎng)過程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次;

3. 培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生10%左右活的單顆漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞密度偏低時，注意收集懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞密度偏高時，可以換液時丟棄;

4. 接種量對細(xì)胞生長有影響，接種量過低細(xì)胞會有增殖緩慢，漂浮過多的現(xiàn)象，請注意控制傳代比例;

5. Bend.3細(xì)胞對溫度和pH較敏感，傳代或換液前培養(yǎng)基可以常溫復(fù)溫4小時以上;避免使用pH改變(偏酸：顏色偏黃;偏堿：顏色偏紫紅)的培養(yǎng)基;

6. Bend.3細(xì)胞傳代過程中若出現(xiàn)單次消化時間過長，可進(jìn)行分次消化，切不可將細(xì)胞強(qiáng)行吹下來，以避免吹打造成細(xì)胞機(jī)械損傷。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞凍存步驟

a.收集bend3細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度1×10⁶~1×10⁷/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在bend3細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1. BEND.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞易老化，傳代幾次細(xì)胞老化?

可能原因分析

1)消化時間問題，該細(xì)胞較易消化，培養(yǎng)箱內(nèi)消化2~3分鐘，但因細(xì)胞較薄，目測不易判斷細(xì)胞是否消化完全，可鏡下觀察細(xì)胞是否回縮， 并用胰酶試吹一下。

2)細(xì)胞密度低時，形態(tài)較大，好似已鋪滿皿底，但細(xì)胞量并不多，如進(jìn)行傳代，細(xì)胞量低，生長緩慢，也造成老化假象。生長緩慢貼壁時間過長，造成細(xì)胞難消化時，需加長消化時間，不可暴力吹打。

2.Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)多樣化的問題，細(xì)胞形態(tài)不一致?

Bend.3細(xì)胞本身生長較慢，在低密度時會呈現(xiàn)不規(guī)則細(xì)胞形態(tài)，高密度時則呈規(guī)則纖維狀，所以若在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，則有可能是細(xì)胞密度低，建議細(xì)胞鋪滿密度較高時傳代。Bend.3細(xì)胞密度較低時，細(xì)胞形態(tài)較大，部分細(xì)胞會出現(xiàn)“太陽花”樣形態(tài)，這是細(xì)胞增殖的一個過程，為正?，F(xiàn)象。

3. Bend.3細(xì)胞消化時間為多久?

Bend.3細(xì)胞培養(yǎng)時間越長越難消化，培養(yǎng)4天傳代，一般消化3-5分鐘；培養(yǎng)7天傳代，一般消化5-10分鐘。具體消化時間以顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。

4. Bend.3細(xì)胞難消化怎么辦？

如遇到消化困難不必?fù)?dān)心，可通過分次消化的方式解決，具體操作方法如下(以T25瓶細(xì)胞為例)：

1)吸出原培養(yǎng)液

2)加入2mL左右PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄;

3)加入1mL左右胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細(xì)胞;

4)放入培養(yǎng)箱消化，消化3-5分鐘(根據(jù)具體細(xì)胞稍作延長或縮短)，顯微鏡下看到細(xì)胞開始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細(xì)胞;

5)吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)的PBS和細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹散細(xì)胞，使細(xì)胞盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液;

6)原培養(yǎng)瓶中加入0.5mL胰酶，晃動培養(yǎng)瓶浸潤細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，直到細(xì)胞塊中間全部收縮變圓，晃動培養(yǎng)瓶可脫落;

7)用3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，將瓶底的細(xì)胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細(xì)胞呈單顆;

8)收集Bend.3細(xì)胞懸液與第一次消化下來的細(xì)胞合并到一個離心管;

9)離心收集細(xì)胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄;

10)加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng);

11)檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。

5.Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞是不是對血清要求比較高？

BEND.3細(xì)胞依賴高質(zhì)量特級血清，對血清要求高。

6.Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過程中建議傳代密度多大？

Bend.3細(xì)胞在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)一般時在密度低于50%時生長到80%約需要4-5天，建議在傳代時盡量密度高于80%。

7.Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞多久換一次液？

Bend.3細(xì)胞培養(yǎng)過程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次。

細(xì)胞文獻(xiàn)溯源

1993年始，迄今為止，關(guān)于小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Bend.3)的文獻(xiàn)已有364篇。

在pubmed數(shù)據(jù)庫中用“Bend.3 cell line”搜索該關(guān)鍵詞，第一篇為1993年E E Sikorski在J Immunol.發(fā)表的“The Peyer's patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin, is induced on a murine endothelial cell line by tumor necrosis factor-alpha and IL-1”。

Bend.3小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

● 小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Bend.3)是從患有內(nèi)皮瘤的小鼠腦組織中分離出來的內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞在神經(jīng)科學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值，因為它們在維持大腦的血液循環(huán)和神經(jīng)血管單元的功能中起著關(guān)鍵作用。微血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的一部分，對于調(diào)節(jié)血液流動、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元通訊都起著關(guān)鍵作用。

● 通過研究Bend.3，研究人員可以更好地其在正常和病理狀態(tài)下的功能，有助于揭示神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)、癲癇等疾病的發(fā)病機(jī)制，并可能為開發(fā)新的治療方法提供思路。

● Bend.3可以用于藥物篩選和評估，幫助研究人員確定哪些藥物可能對治療與血管功能障礙相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有效。

● 研究人員可以利用Bend.3進(jìn)行血腦屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)的相關(guān)研究，如炎癥和氧化應(yīng)激對血腦屏障完整性的影響，這對于理解神經(jīng)炎癥性疾病和腦老化過程具有重要意義。

● Bend.3細(xì)胞還可以用于研究包括細(xì)胞損傷和凋亡、藥物轉(zhuǎn)運和代謝、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞保護(hù)、基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制，以及細(xì)胞模型建立。

bEnd.3細(xì)胞標(biāo)志物

小鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞Bend.3的標(biāo)志物包括vWF、CD34、CD31、CD105、Flk-1、PECAM-1、VE-cadherin、ICAM-1、VCAM-1和CD62E等。這些標(biāo)志物用于識別和研究內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能。

bEnd.3細(xì)胞參考文獻(xiàn)

Montesano R, et al. Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell 62: 435-445, 1990. PubMed: 2379237

Sikorski EE, et al. The Peyer's patch high endothelial receptor for lymphocytes, the mucosal vascular addressin, is induced on a murine endothelial cell line by tumor necrosis factor-alpha and IL-1. J. Immunol. 151: 5239-5250, 1993. PubMed: 7693807

Williams RL, et al. Embryonic lethalities and endothelial tumors in chimeric mice expressing polyoma virus middle T oncogene. Cell 52: 121-131, 1988. PubMed: 3345558