MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞背景簡介

MDA-MB-231細(xì)胞是一種人類乳腺癌細(xì)胞系，通常呈貼壁生長狀態(tài)，具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，呈現(xiàn)出較大、扁平的形狀，有時會呈現(xiàn)出長條狀，增殖速度較快。MDA-MB-231是從一名51歲的白人女性乳腺癌患者的胸水中分離建立的。該細(xì)胞表達(dá)表皮生長因子EGF受體、TGF-α受體和WNT7B癌基因。

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞形態(tài)特征

MDA-MB-231屬上皮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)大多為紡錘狀，小部分呈圓形。

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：MDA-MB-231，人乳腺癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：MDA-MB 231; MDA.MB.231; MDA MB 231; MDA MB231; MDA Mb231; MDA-MB231; MDAMB-231; MDAMB231; MDA-231; MDA231; MB231; MD Anderson-Metastatic Breast-231;人乳腺癌細(xì)胞

種屬來源：人

年齡性別：女;51歲

組織來源：乳腺腺癌，轉(zhuǎn)移性胸膜滲出液

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

染色體：58~61，有巨核

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：12，13;D13S317：13;D16S539：12;D18S51：11，16;D19S433：11，14;D21S11：30，33.2;D2S1338：20，21;D3S1358：16;D5S818：12;D7S820：8，9;D8S1179：13;FGA：22，23;TH01：7，9.3;TPOX：8，9;vWA：15，18;

保藏機構(gòu)：ATCC; CRL-12532 ATCC; HTB-26 ATCC; CRM-HTB-26 BCRC; 60425 BCRJ; 0164 DSMZ; ACC-732 ECACC; 92020424

培養(yǎng)基：90% DMEM +10% FBS+1%PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

倍增時間：~32-42 hours

致瘤性：Yes, in ALS treated BALB/c mice, forms poorly differentiated adenocarcinoma (grade III).Yes, in nude mice, forms poorly differentiated adenocarcinoma (grade III).

受體表達(dá)情況：epidermal growth factor (EGF), expressed;transforming growth factor alpha (TGF alpha), expressed

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將MDA-MB-231細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定MDA-MB-231細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)。

MDA-MB-231細(xì)胞傳代操作方法

1)從培養(yǎng)箱拿出MDA-MB-231細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進行傳代;

2)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

3)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

4)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

5)將裝有MDA-MB-231細(xì)胞懸液的離心管放入離心機中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

6) 確定MDA-MB-231細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞凍存步驟

a.收集MDA-MB-231細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞的區(qū)別

1.MCF-7和MDA-MB-231雖說都是乳腺癌細(xì)胞，但是二者的侵襲能力不一樣，細(xì)胞形態(tài)差別巨大，有些基因表達(dá)也不同，比如SP7在MCF7細(xì)胞中就不表達(dá)，但是在MDA-MB-231中表達(dá)很高。增殖速度相對來說MDA-MB-231更快一些。

2.MDA-MB-231屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞系，易成瘤，且常用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究，常見為肺轉(zhuǎn)移。

MCF-7為原位ER陽性乳腺癌細(xì)胞系，惡性程度較MDA-MB-231低，因此不那么容易成瘤，但在雌激素刺激下還是可以作為很好動物成瘤模型的。

MDA-MB-231細(xì)胞文獻(xiàn)溯源

1974年始，迄今為止，關(guān)于人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)的文獻(xiàn)已有19940篇。

在pubmed數(shù)據(jù)庫中用“mda-mb-231 cells”搜索該關(guān)鍵詞，第一篇為1974年R Cailleau在J Natl Cancer Inst.發(fā)表的“Breast tumor cell lines from pleural effusions”。

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

● 人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231是一種上皮樣細(xì)胞，從患有腺癌的40歲白人女性的乳腺中分離出來。該細(xì)胞可用于試驗開發(fā)。

● 學(xué)者經(jīng)常利用MDA-MB-231細(xì)胞進行針對乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制研究，包含細(xì)胞黏附、細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的擴散、侵襲和血管生產(chǎn)成本等。

● 分子靶向治療是乳腺癌治療的一個重要領(lǐng)域，特別是在針對特定基因突變的治療策略方面。例如，學(xué)者利用MDA-MB-231細(xì)胞中研究常見的過表達(dá)蛋白，如HER2/ERBB2，進而評估針對HER2/ERBB2的靶向藥物對MDA-MB-231細(xì)胞系的作用，以確定其對乳腺癌的治療潛力。

● 通過使用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，研究人員能夠精確地敲除或過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞中的特定基因。有利于系統(tǒng)地研究這些基因在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，從而揭示腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制。

● 使用MDA-MB-231細(xì)胞建立3D培養(yǎng)模型，能更真實地模擬腫瘤在體內(nèi)的生長和行為，為研究提供了更為接近生理狀態(tài)的實驗平臺。

● 在藥物篩選和開發(fā)方面，利用MDA-MB-231細(xì)胞系進行高通量藥物篩選，能夠發(fā)現(xiàn)新的抗乳腺癌藥物，并開發(fā)針對該細(xì)胞系的治療方法，為乳腺癌的治療提供了新的可能性。

細(xì)胞標(biāo)志物

MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的標(biāo)志物包括ER、PR、HER2、MMP家族、Cyclin D1、p53、Bcl-2家族蛋白、CD44、CD24和ALDH等。這些標(biāo)志物用于識別、研究和治療乳腺癌細(xì)胞。

MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞應(yīng)用

MDA-MB-231可以用于苦參堿聯(lián)合多西他賽促進三陰性人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的機制研究

在人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中探索苦參堿和多西他賽聯(lián)合使用對細(xì)胞增殖和凋亡等的影響;在此基礎(chǔ)上利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)研究苦參堿聯(lián)合多西他賽抗人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的進一步分子機制,并進行體外、體內(nèi)實驗驗證。

方法

1.通過CCK-8、克隆形成、Transwell、劃痕實驗、流式細(xì)胞術(shù)等實驗探索不同濃度的苦參堿和多西他賽單藥及聯(lián)合用藥對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響,在此基礎(chǔ)上選取苦參堿(1mM)、多西他賽(10nM)和聯(lián)合用藥(苦參堿1mM+多西他賽10nM)等模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡等作用。用蛋白印跡實驗檢測上述用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Caspase和Bcl-2家族相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

2.利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)研究苦參堿聯(lián)合多西他賽抗人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的靶分子,并通過相關(guān)實驗驗證。質(zhì)粒過表達(dá)該分子后,采用聯(lián)合用藥的處理模式檢驗靶分子過表達(dá)后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞表型和Caspase家族相關(guān)蛋白質(zhì)變化情況。

3.建立人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞BALB/c裸鼠移植瘤模型,待腫瘤體積達(dá)到約100mm3時,將裸鼠隨機分為如下4組,每組8只,并進行如下處理:①對照組(Control):等體積的生理鹽水,腹腔注射,5次/周,共計15次。②苦參堿組(Mat):苦參堿500mg/kg,腹腔注射,5次/周,共計15次。③多西他賽組(Doc):多西他賽8mg/kg,腹腔注射,1次/周,共計3次。④聯(lián)合組(Comb):苦參堿+多西他賽(苦參堿50mg/kg,腹腔注射,5次/周,共計15次;多西他賽8mg/kg,腹腔注射,1次/周,共計3次)。研究過程中觀察各組荷瘤裸鼠的一般情況,測量裸鼠體重、腫瘤體積等指標(biāo)。達(dá)到實驗要求后采血后送檢血常規(guī)、肝功能,脫頸處死裸鼠,剝離裸鼠腫瘤,拍照記錄并測量腫瘤組織質(zhì)量。分別進行腫瘤組織的HE染色、Tunel染色及相關(guān)蛋白的免疫組化檢測。

結(jié)果

1.苦參堿和多西他賽單藥均呈一定程度的濃度及時間依賴性的方式抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡能力,兩藥聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。蛋白印跡實驗證實:苦參堿和多西他賽單藥作用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后,Cleaved-caspase-3、-8、-9及Bax等促凋亡蛋白表達(dá)均有所上調(diào),而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)有所下降,兩藥聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。

2.蛋白組學(xué)分析提示HN1是苦參堿處理人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后的下調(diào)蛋白之一(Fold change:0.61);苦參堿聯(lián)合多西他賽的用藥模式對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、遷移及促凋亡能力可被過表達(dá)HN1所抵消。

3.苦參堿與多西他賽的聯(lián)合用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積和瘤重的抑制起到協(xié)同作用,免疫組化檢測提示聯(lián)合用藥的給藥模式在抑制腫瘤組織中CD31、VEGF、Cleaved-caspase-3、HN1的表達(dá)方面具有協(xié)同作用,并且這種用藥模式對裸鼠的一般狀況、體重、肝功能和血常規(guī)均無明顯影響。

結(jié)論

苦參堿(1mM)聯(lián)合多西他賽(10nM)的用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的抗腫瘤作用具有協(xié)同作用,該作用可能是通過下調(diào)HN1表達(dá)來實現(xiàn)的?？鄥A與多西他賽的聯(lián)合用藥模式對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的體積和瘤重的抑制起到協(xié)同作用,且對裸鼠的一般狀況、體重、肝功能和血常規(guī)均無明顯影響。