MKN-7人胃癌細(xì)胞來源

MKN-7細(xì)胞是在1989由Hojo, H從一位39歲男性患者的高分化的胃管狀腺癌中建立的。MKN-7細(xì)胞高表達(dá)c-erb B2的產(chǎn)物。

MKN-7人胃癌細(xì)胞形態(tài)特征

MKN-7人胃癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：MKN-7，人胃癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：MKN-7; MKN 7;MKN7; 人胃癌細(xì)胞

種屬來源：人

年齡性別：女，39歲

組織來源：胃

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,13;D3S1358：17;D5S818：9,13;D7S820：9,11;D8S1179：15;D13S317：8,12;D16S539：9,10;D18S51：13,18;D21S11：29,32.2;FGA：23;Penta D：10,11;Penta E：18;TH01：7,9;TPOX：9;vWA：17;

保藏機(jī)構(gòu)：CLS; 305104;JCRB; JCRB1025;RCB; RCB0999;RCB; RCB3687;TKG; TKG 0228;

培養(yǎng)基：RPMI-1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)條件：氣相：100%空氣;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

MKN-7人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

MKN-7人胃癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLMKN-7細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻MKN-7細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定MKN-7細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

MKN-7人胃癌細(xì)胞傳代操作

1)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

2)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

3)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個MKN-7細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)MKN-7細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

4)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有MKN-7細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

5)將裝有細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

6) 確定MKN-7細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

MKN-7人胃癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

MKN-7細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)MKN-7細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

MKN-7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

a.生長速度很慢

MKN-7人胃癌細(xì)胞倍增時間約3天左右，正常培養(yǎng)5~7天可傳代一次;

b.貼壁形態(tài)展開較大

MKN-7人胃癌細(xì)胞消化之后一瓶細(xì)胞量比較少，傳代時的比例建議1：2，凍存時1瓶細(xì)胞只能凍一管;

c.折光度較低

MKN-7人胃癌細(xì)胞在顯微鏡下觀察時，輪廓有時不清晰，觀察時顯微鏡亮度請勿太高，否則可能看不到細(xì)胞邊界;

d.較難消化

常規(guī)的消化方法難以把控，加入培養(yǎng)基后細(xì)胞會迅速貼壁。建議使用浸泡消化，使用胰酶完全浸潤MKN-7人胃癌細(xì)胞，直接放入37℃ 的環(huán)境中進(jìn)行消化，消化時間一般在7~10分鐘。

待部分細(xì)胞脫壁漂起后，鏡下觀察，大部分細(xì)胞有脫壁跡象后加入適量胰酶，輕輕吹打，將細(xì)胞吹落、吹散，隨后吸出器皿，加入培養(yǎng)基終止消化，離心收集。

若還有少量細(xì)胞無法輕輕吹下，則在吸出脫落細(xì)胞后，加入胰酶繼續(xù)消化再收集。

小貼士：使用這種消化方法，可能會造成一定的細(xì)胞損失。

MKN-7人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.MKN-7人胃癌細(xì)胞傳代密度

MKN-7細(xì)胞呈上皮樣生長，是密度依賴型細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量直接影響細(xì)胞生長速度。建議融合度90%以上再進(jìn)行傳代。

2.MKN-7人胃癌細(xì)胞消化時間多久

MKN-7細(xì)胞不易消化，消化時間建議培養(yǎng)箱5分鐘以上，顯微鏡下觀察細(xì)胞全部脫落，再終止消化。終止后，建議使用完培收集2-3次，盡量減少操作損失。

3.MKN-7細(xì)胞凍存密度多大

凍存MKN-7人胃癌細(xì)胞時，建議密度要略大于普通細(xì)胞(兩盤10cm皿凍3管)，以保證復(fù)蘇后細(xì)胞量。

MKN-7人胃癌細(xì)胞應(yīng)用

MKN7人胃癌貼壁細(xì)胞系可以用于PNO1通過自噬效應(yīng)促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究

自噬作為一種程序性死亡機(jī)制在腫瘤中的作用越來越受到研究者們的關(guān)注,靶向自噬已經(jīng)成為腫瘤治療的一種重要手段。之前的研究表明核糖體裝配因子PNO1可以調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲、自噬和凋亡等表型,但目前在胃癌中的作用還沒有被報道。本研究旨在揭示PNO1在胃癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制,為胃癌治療提供新的靶標(biāo)。

方法：利用生物數(shù)據(jù)庫中的信息檢測PNO1在胃癌和癌旁組織中的表達(dá),并收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的胃癌和癌旁手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析驗證,使用小干擾RNA、慢病毒顆粒構(gòu)建PNO1敲低和過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株,使用蛋白免疫印跡和實時定量PCR來驗證PNO1在胃癌細(xì)胞的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率,通過平板克隆形成實驗和Ed U細(xì)胞增殖實驗檢測PNO1對胃癌細(xì)胞增殖的影響,使用蛋白免疫印跡和免疫熒光實驗檢測PNO1對自噬的調(diào)節(jié),通過蛋白免疫印跡分析PNO1對PI3K/AKT/mtor信號通路的調(diào)控作用,最后通過小鼠胃原位荷瘤模型驗證PNO1在體內(nèi)對胃癌增殖的作用。

結(jié)果：在本研究中,發(fā)現(xiàn)PNO1在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)并且相對高表達(dá)的PNO1水平與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān),過表達(dá)PNO1提高了胃癌細(xì)胞的增殖水平,敲低PNO1抑制了體內(nèi)外胃癌的增殖能力,并提高了胃癌細(xì)胞的自噬水平,抑制自噬逆轉(zhuǎn)了PNO1敲低導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力下降的趨勢,此外,敲低PNO1還抑制了PI3K/AKT/mtor信號通路的激活。

結(jié)論：研究表明PNO1高表達(dá)是胃癌患者的不良預(yù)后因素,PNO1通過抑制自噬效應(yīng)促進(jìn)了胃癌的增殖能力,這為探索胃癌發(fā)病機(jī)制提供了新的思路,靶向PNO1/自噬軸成為胃癌治療的潛在方案。

參考文獻(xiàn)

[1]RBM47/SNHG5/FOXO3 axis activates autophagy and inhibits cell proliferation in papillary thyroid carcinoma.[J].Qin Yuan;Sun Wei;Wang Zhihong;Dong Wenwu;He Liang;Zhang Ting;Lv Chengzhou;Zhang Hao.Cell death&disease,2022(3)

[2]Muyin extract inhibits non-small-cell lung cancer growth by inducing autophagy and apoptosis in vitro and in vivo[J].Kan Yueyi;Song Min;Cui Xihe;Yang Qing;Zang Yuanlong;Li Qi;Li Yujie;Cai Weiyan;Chen Ying;Weng Xiaogang;Wang Yajie;Zhu Xiaoxin.Phytomedicine,2022

[3]Hallmarks of Cancer:New Dimensions.[J].Hanahan Douglas.Cancer discovery,2022(1)

[4]Ginsenoside Rg5 Inhibits Human Osteosarcoma Cell Proliferation and Induces Cell Apoptosis through PI3K/Akt/mTORC1-Related LC3 Autophagy Pathway[J].Liu Ming-Yang;Liu Fei;Li Yan-Jiao;Yin Jia-Ning;Gao Yan-Li;Wang Xin-Yue;Yang Chen;Liu Jian-Guo;Li Hai-Jun;Cordani Marco.Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2021

[5]王功竣.PNO1通過自噬效應(yīng)促進(jìn)胃癌增殖的機(jī)制研究[D].青島大學(xué),2022.