SH-SY5Y人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)研究，該細(xì)胞系是SK-N-SH細(xì)胞系的亞系，于1970年從4歲女性轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細(xì)胞瘤的骨髓穿刺活檢中建立，該細(xì)胞系包括兩種形態(tài)上不同的細(xì)胞類型，一種為成神經(jīng)細(xì)胞，另一種為上皮樣細(xì)胞。SH-SY是來(lái)源于SH-N-SH的成神經(jīng)細(xì)胞亞系，SH-SY5是SH-SY的亞系，SH-SY5Y是SH-SY5的亞系，經(jīng)歷了三輪克隆選擇最終形成。

sh-sy5y cells是人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，它衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK2N 2SH。這些細(xì)胞具有神經(jīng)突樣的細(xì)胞質(zhì)突起，是研究神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病常用的動(dòng)物模型。SH-SY5Y細(xì)胞能夠表達(dá)GABA受體、谷氨酸受體等功能的亞型，并參與多種神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放。在臨床醫(yī)學(xué)中，SHSY5Y常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療的研究，如阿爾茨海默病、癲癇等。此外，它還可以作為一種工具來(lái)探索其他藥物的作用機(jī)制以及其對(duì)正常生理功能的影響。

sh-sy5y cells衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK2N 2SH ,它具有表達(dá)兒茶酚胺能神經(jīng)元特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺2B2羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體, 該細(xì)胞系被廣泛運(yùn)用于PD 發(fā)病機(jī)制的研究。

SH-SY5Y人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞形態(tài)特征

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：SH-SY5Y，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

細(xì)胞別稱：SHSY5Y; SHSY-5Y; SH-Sy5y; SK-SH-SY5Y; SY5Y;人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞

種屬來(lái)源：人

年齡性別：女;4歲

組織來(lái)源：腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移部位骨髓

生長(zhǎng)特性：半貼壁生長(zhǎng)(貼壁和懸浮同時(shí)存在)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11;D13S317：11;D16S539：8，13;D18S51：13，16;D19S433：13，14;D21S11：31，31.2;D2S1338：17，19;D3S1358：15，16;D5S818：12;D7S820：7，10;D8S1179：15;FGA：23.2，24;TH01：7，10;TPOX：8，11;vWA：14，18;

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-2266 DSMZ; ACC-209 ECACC; 94030304 ;中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)

培養(yǎng)基：43%MEM+43%F12+10%FBS+1% MEM NEAA(非必需氨基酸)+1%丙酮酸鈉+1% GlutaMAX-1+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

倍增時(shí)間：~48-72 hours

抗原表達(dá)情況：Blood Type A; Rh+

染色體：81~92

sh-sy5y細(xì)胞系特征

1. 成團(tuán)簇的形式生長(zhǎng)

2. 由于SH-SY5Y細(xì)胞是三維團(tuán)簇的方式生長(zhǎng)，復(fù)蘇和傳代后會(huì)重新附著為三維島(會(huì)有一些不會(huì)重新附著的簇)。生長(zhǎng)最終會(huì)從島嶼狀慢慢擴(kuò)散開(kāi)來(lái)，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞會(huì)緩慢變成單層，這個(gè)時(shí)候細(xì)胞基本處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

3. SH-SY5Y細(xì)胞是一種本身生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞 70~80% 的匯合度，即可進(jìn)行分瓶處理，一般T25培養(yǎng)瓶建議1:2傳代，每周可傳代2~3次，如果細(xì)胞生長(zhǎng)速度比正常的時(shí)候更慢，可以適當(dāng)提高血清到20%有利于促進(jìn)生長(zhǎng)。

4. SH-SY5Y細(xì)胞在復(fù)蘇、傳代后，細(xì)胞會(huì)有一些漂浮狀態(tài)，這些漂浮細(xì)胞是正常現(xiàn)象，可以視為混合的貼壁和懸浮細(xì)胞系。一般復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)3天后漂浮細(xì)胞會(huì)再繼續(xù)粘附貼壁。直到生長(zhǎng)從島嶼擴(kuò)散開(kāi)來(lái)并且在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)伸展開(kāi)，通常在進(jìn)行換液的時(shí)候我們會(huì)補(bǔ)加培養(yǎng)基，如果一定要全換液，可以通過(guò)離心收集懸浮細(xì)胞以1000轉(zhuǎn)5min，并將懸浮細(xì)胞接種到新培養(yǎng)瓶。

5. SH-SY5Y細(xì)胞密度低時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，接種密度建議啟動(dòng)接種密度：8.0×104至 1.5× 105活細(xì)胞/cm2為宜，繼代培養(yǎng)的接種密度：4.0 × 104至 1.0×105 活細(xì)胞/cm2。

sh-sy5y細(xì)胞培養(yǎng)方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：MEM、F12、NEAA(非必需氨基酸)、丙酮酸鈉、GlutaMAX-1、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái) 30min，提前打開(kāi)水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放 30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過(guò)夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代方法

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

4)打開(kāi)廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無(wú)菌離心管中。

7)將裝有細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

8) 確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞傳代小貼士

1. 培養(yǎng)該SH-SY5Y細(xì)胞要有耐心，不能看見(jiàn)抱團(tuán)或不貼壁，就急著處理或頻繁觀察，給細(xì)胞穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境和時(shí)間成長(zhǎng)。

2. SH-SY5Y細(xì)胞消化時(shí)，肉眼很快會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫落，不要著急終止消化，因細(xì)胞團(tuán)塊雖然脫落，但細(xì)胞之間的蛋白還緊密連接。所以稀釋消化液，延長(zhǎng)消化時(shí)間很關(guān)鍵。

3. 根據(jù)SH-SY5Y細(xì)胞特點(diǎn)，一定要正確判斷細(xì)胞密度，如感覺(jué)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，5-6天還不能傳代，可消化下來(lái)計(jì)數(shù)判斷。該細(xì)胞大部分呈貼壁生長(zhǎng)，根據(jù)情況，如懸浮量少，可不回收。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凍存方法

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80 度凍存盒里，放置 24 小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

SH-SY5Y細(xì)胞凍存小貼士

1.凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會(huì)待液氮完全蒸發(fā)后再水??；

2.水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴，避免過(guò)度水浴或水浴時(shí)間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞，避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞；

5.復(fù)蘇后的SH-SY5Y細(xì)胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞；

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y培養(yǎng)建議

1. 貼壁弱，消化時(shí)間短，注意控制消化時(shí)間;

2. 細(xì)胞傳代容易成團(tuán)聚集，可以通過(guò)控制細(xì)胞密度不超過(guò)80%，當(dāng)密度到達(dá)或超過(guò)80%及時(shí)傳代，傳代時(shí)切勿暴力吹打，避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械刺激，同時(shí)注意盡量吹散細(xì)胞;

3. 細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢，注意控制細(xì)胞密度不要過(guò)低;細(xì)胞密度過(guò)高時(shí)及時(shí)傳代，避免培養(yǎng)基變黃導(dǎo)致細(xì)胞脫落或者狀態(tài)變差。

4. MEM/F12以及DMEM/F12都可以培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，但不同培養(yǎng)基培養(yǎng)之后會(huì)有部分形態(tài)差異;

5. SH-SY5Y細(xì)胞是成簇生長(zhǎng)，飽和度高，其表現(xiàn)會(huì)是鏡下觀察密度低，但每團(tuán)細(xì)胞簇密度大，可以根據(jù)培養(yǎng)基顏色進(jìn)行換液;

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

SH-SY5Y細(xì)胞收到貨細(xì)胞皺縮脫落怎么處理？

常溫運(yùn)輸過(guò)程中，sh-sy5y cells不免受到震蕩和溫度變化的影響，出現(xiàn)皺縮、聚團(tuán)甚至脫落的現(xiàn)象。遇到這種情況，不用緊張，只要正確處理，細(xì)胞就能恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

常溫細(xì)胞收貨后，把sh-sy5y cells放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置4小時(shí)即可。

脫落后的細(xì)胞通常聚團(tuán)漂浮，通過(guò)離心將漂浮的細(xì)胞團(tuán)收集起來(lái)，在離心管里進(jìn)行胰酶消化后重新鋪板即可。

貼壁細(xì)胞常規(guī)方法消化下來(lái)，和處理好的脫落細(xì)胞合并，混勻后鋪板。

1.SH-SY5Y脫落處理步驟

a. 1000rpm(約250g)4min離心收集細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基;

b. PBS 重懸細(xì)胞，再次 1000rpm(約250g)4min離心，去除PBS;

c. 加入 1mL左右 0.25%胰酶重懸細(xì)胞，吹打1-2下吹起沉淀即可;

d. 放入細(xì)胞培養(yǎng)箱約 5-8min;

e. 用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞團(tuán)分散;

f. 迅速加入 3-5mL含血清的培養(yǎng)基混勻以終止消化;

g. 1000rpm(約250g)4min離心，去除胰酶;

h. 加入新鮮培養(yǎng)基按合適比例接入無(wú)菌培養(yǎng)器皿中;

2.SH-SY5Y細(xì)胞復(fù)蘇后成團(tuán)，不貼壁，不能平鋪皿底？

復(fù)蘇后，鏡下觀察會(huì)有部分成團(tuán)，不要著急吹打分散，因?yàn)榧?xì)胞剛復(fù)蘇，比較脆弱。輕柔吹勻，即可放入培養(yǎng)箱，放入后不要再移動(dòng)。

復(fù)蘇第一天，如圖貼壁細(xì)胞抱團(tuán)貼壁，且部分貼壁部分飄起的大細(xì)胞團(tuán)。這時(shí)你要觀察細(xì)胞的活率，看看如死細(xì)胞較多，可再放置一天后處理?？筛鶕?jù)情況補(bǔ)液，不可直接換液。

3.SH-SY5Y細(xì)胞非常敏感，在受到溫度、化學(xué)或物理刺激后容易出現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象？

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞同時(shí)存在，貼壁細(xì)胞呈上皮樣，有短觸角延伸出來(lái)，傾向于成簇生長(zhǎng)，容易成團(tuán)。

懸浮細(xì)胞過(guò)多：SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)有少量懸浮細(xì)胞，是正?，F(xiàn)象。 如果出現(xiàn)大量懸浮的細(xì)胞，就需要引起注意了。

處理方法：換液時(shí)將懸浮細(xì)胞離心收集，新鮮培養(yǎng)基重懸后接種回原瓶/原皿。當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、密度適中時(shí)，可以舍棄懸浮細(xì)胞。

成團(tuán)嚴(yán)重：SH-SY5Y細(xì)胞非常敏感，在受到溫度、化學(xué)或物理刺激后容易出現(xiàn)成團(tuán)現(xiàn)象。一個(gè)視野下，有少量成團(tuán)現(xiàn)象，無(wú)需特殊處理。成團(tuán)幾乎沒(méi)有鋪展開(kāi)的細(xì)胞時(shí)，就需要按以下方法特殊處理一下了。

成團(tuán)較嚴(yán)重的SH-SY5Y細(xì)胞處理方法

方法1：低密度接種，用0.125%的低濃度胰蛋白酶消化細(xì)胞(時(shí)間不超過(guò)5min)，按1：6比例傳代接種，并換新的培養(yǎng)器皿。 延長(zhǎng)換液時(shí)間，3天換液一次，防止細(xì)胞脫落。

方法2：使用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)器皿，以加快細(xì)胞貼壁速度，降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率。

方法3：重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，并加大血清比例(不超過(guò)20%)

方法4：接種時(shí)，減少培養(yǎng)基量(如T25加3mL)以加快細(xì)胞貼壁速度，等待細(xì)胞貼壁后(約8-12小時(shí))，再補(bǔ)加培養(yǎng)基。

預(yù)防成團(tuán)的方法

1 控制細(xì)胞密度不超過(guò)80%，當(dāng)密度到達(dá)或超過(guò)80%及時(shí)傳代;傳代時(shí)切勿暴力吹打，避免對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械刺激

2 使用質(zhì)量好的細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清，減少內(nèi)毒素等有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的刺激

3 請(qǐng)勿頻繁把細(xì)胞從培養(yǎng)箱拿出，氣溫低時(shí)需開(kāi)暖氣維持細(xì)胞房溫度;使用PBS、培養(yǎng)基前37度預(yù)熱，以避免溫差對(duì)細(xì)胞造成刺激

4.SH-SY5Y細(xì)胞消化時(shí)間多久?

根據(jù)貼壁時(shí)間，培養(yǎng)箱靜置消化5-8分鐘，SH-SY5Y細(xì)胞易成團(tuán)。

5.培養(yǎng)過(guò)程中SH-SY5Y細(xì)胞碎片較多怎么處理?

a.細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

b.細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等SH-SY5Y細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞特點(diǎn)

1. 細(xì)胞貼壁較弱

細(xì)胞貼壁比較弱，因此在遇到運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗帯⑹覝仂o置太長(zhǎng)時(shí)間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過(guò)冷、密度較高、聚集未吹散、加液吹打到細(xì)胞面等情況時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象，此時(shí)若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若呈大片脫落的情況時(shí)需要收集細(xì)胞重新消化吹散并接種;建議使用經(jīng)過(guò)包被或者高貼壁培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，盡量避免接觸低溫或密度過(guò)高;

2. 細(xì)胞本身偏嗜酸性，消耗培養(yǎng)基較快

有細(xì)胞在略微偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)比偏堿性的好，注意培養(yǎng)基pH控制;細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)，培養(yǎng)基消耗會(huì)很快，主意及時(shí)觀察并換液;

3. 細(xì)胞生長(zhǎng)到完全匯合時(shí)間較長(zhǎng)

細(xì)胞呈島狀生長(zhǎng)，生長(zhǎng)是逐漸向外發(fā)射狀增多，最終生長(zhǎng)成片，但仍會(huì)有較多細(xì)胞間間隙;

4. 細(xì)胞聚團(tuán)后很難再吹散

細(xì)胞傳代過(guò)程中一定要注意吹散細(xì)胞，接種密度不要過(guò)高，否則接種后細(xì)胞聚團(tuán)將很難再吹散，會(huì)形成類似神經(jīng)球的聚集體貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件合適的情況下細(xì)胞會(huì)逐漸攤開(kāi)生長(zhǎng)，但若培養(yǎng)條件無(wú)法有效促進(jìn)細(xì)胞貼壁，可能會(huì)長(zhǎng)時(shí)間呈球狀增殖;

5.生長(zhǎng)異常緩慢

當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)一周都無(wú)法傳代時(shí)，可以將細(xì)胞消化下來(lái)，接種到更小的容器中，人為增加細(xì)胞密度，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。平時(shí)傳代時(shí)也要注意接種密度不能太低。

6.能否使用DMEM/F12

MEM/F12和DMEM/F12都可以培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)，并且都有相應(yīng)的文獻(xiàn)支持。但這兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的形態(tài)會(huì)有細(xì)微差異。 另外，使用品質(zhì)好的胎牛血清將極大改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞特性

神經(jīng)母細(xì)胞瘤呈現(xiàn)為藍(lán)染的小圓形細(xì)胞，菊花形排列。腫瘤細(xì)胞圍繞神經(jīng)氈(neuropil)呈菊花形排列，與其他的腫瘤(如視神經(jīng)母細(xì)胞瘤)圍繞血管呈菊花形排列有所不同。其他還有一些神經(jīng)母細(xì)胞瘤所特異的免疫組化染色，用以與其他腫瘤(尤因肉瘤，淋巴瘤等)進(jìn)行鑒別診斷。

SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟

SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中常用的模型系統(tǒng)，廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)研究。轉(zhuǎn)染SH-SY5Y 細(xì)胞是一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在基因功能研究、蛋白表達(dá)和定量分析等方面扮演著關(guān)鍵角色。然而，由于SH-SY5Y細(xì)胞的特殊性質(zhì)，使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法可能會(huì)遇到一些困難。以下介紹一種優(yōu)化的SH-SY5Y 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，并詳細(xì)描述每個(gè)步驟。

材料與試劑

SH-SY5Y細(xì)胞系：可從Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences或其他來(lái)源獲得。

細(xì)胞培養(yǎng)基：Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/F12混合培養(yǎng)基。

熱穩(wěn)定型胰酶：用于細(xì)胞的傳代與分離。

轉(zhuǎn)染試劑：例如，聚乙烯亞胺(PEI)、脂質(zhì)體等。

目標(biāo)基因的質(zhì)粒DNA或siRNA：用于轉(zhuǎn)染和表達(dá)。

Opti-MEM：用于稀釋轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒。

準(zhǔn)備SH-SY5Y細(xì)胞

1. 獲得SH-SY5Y細(xì)胞系并進(jìn)行培養(yǎng)。

2. 在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入10 ml完整的MEM/F12培養(yǎng)基及10%胎牛血清(FBS)。

3. 將SH-SY5Y細(xì)胞從細(xì)胞凍存管中復(fù)蘇，并將細(xì)胞傳遞至培養(yǎng)瓶中。

4. 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞達(dá)到80-90%的密度。

轉(zhuǎn)染前的預(yù)處理

1. 轉(zhuǎn)染前用DMEM/F12培養(yǎng)基含10% FBS對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。

2. 將細(xì)胞培養(yǎng)至80-90%的密度。

3. 用1X PBS洗滌細(xì)胞2次，去除細(xì)胞內(nèi)的殘留培養(yǎng)基。

轉(zhuǎn)染操作

1. 根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的使用說(shuō)明，將轉(zhuǎn)染試劑稀釋至合適的濃度，如使用PEI轉(zhuǎn)染，可在Opti-MEM中稀釋PEI至最終濃度。

2. 在另一個(gè)離心管中將質(zhì)粒DNA或siRNA按照使用的量稀釋至合適體積，并在Opti-MEM中混合均勻。

轉(zhuǎn)染操作步驟

1. 向細(xì)胞中加入預(yù)先稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑，注意不要形成氣泡并避免細(xì)胞過(guò)度干擾。

2. 輕輕震蕩培養(yǎng)瓶，使轉(zhuǎn)染試劑均勻分布。

3. 將稀釋好的質(zhì)粒DNA或siRNA加入到培養(yǎng)基中，與轉(zhuǎn)染試劑充分混合，避免形成沉淀。

4. 震蕩培養(yǎng)瓶并置于37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 根據(jù)研究需求，在48-72小時(shí)后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(如蛋白表達(dá)、基因敲除等)。

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞應(yīng)用

SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)分化與神經(jīng)退行性疾病的應(yīng)用

SH-SY5Y細(xì)胞可以制備成未分化和分化兩種形式，兩種SH-SY5Y細(xì)胞都被用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的體外實(shí)驗(yàn)研究。在未分化狀態(tài)下，SH-SY5Y細(xì)胞不能完全表現(xiàn)出原代神經(jīng)元的某些特征。通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加特定化合物，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞可以分化為更成熟的神經(jīng)元樣細(xì)胞，表現(xiàn)出膽堿能、腎上腺素能或多巴胺能表型。

完全分化的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞比其未分化的前體細(xì)胞更接近于體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的成熟人類神經(jīng)元。此外，SH-SY5Y細(xì)胞可以進(jìn)行基因遺傳操作，包括基于轉(zhuǎn)基因的基因敲除或病毒誘導(dǎo)地過(guò)表達(dá)，因此適合研究與疾病相關(guān)的基因功能。本文闡述SH-SY5Y細(xì)胞系的神經(jīng)分化方法，SH-SY5Y細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病，尤其在帕金森病、阿爾茨海默病等實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用。

SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)分化

未分化的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)特征為神經(jīng)母細(xì)胞樣、未極化的胞體，突起少而截?cái)?。這些細(xì)胞傾向于成簇生長(zhǎng)，并可能形成團(tuán)塊。未分化的SH-SY5Y細(xì)胞持續(xù)增殖，表達(dá)不成熟的神經(jīng)元標(biāo)記，缺乏成熟的神經(jīng)元標(biāo)記。

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同的分化方法可以分化為膽堿能、腎上腺素能或多巴胺能表型，分化的特征是細(xì)胞增殖停止，以及形態(tài)、生化和功能改變。形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞突起明顯延長(zhǎng);生化變化包括神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)劑、酶活性、神經(jīng)組織特異性蛋白和囊泡蛋白的增加;從功能上講，細(xì)胞的膜電位增加，導(dǎo)致細(xì)胞興奮性增強(qiáng)。

多種化合物可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化，常用的分化劑有維甲酸、十四烷基佛波醇醋酸酯、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。另外，神經(jīng)生長(zhǎng)因子、星形孢子素、17β-雌二醇、膽固醇、二丁酰環(huán)磷腺苷、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、胰高血糖素樣肽-1等也可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化。

不同的分化劑組合，不同的培養(yǎng)環(huán)境也可促進(jìn)細(xì)胞分化為更接近于體內(nèi)的成熟人類神經(jīng)元，分化后的SH-SY5Y細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生化和功能改變。SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)過(guò)逐漸去除血清，添加維甲酸、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，以及連續(xù)裂解來(lái)篩選分化的成熟貼壁神經(jīng)元形成完全分化的SH-SY5Y神經(jīng)元，比未分化的細(xì)胞更接近于成熟人類神經(jīng)元。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是軸突標(biāo)記物tau和樹(shù)突狀微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)和調(diào)節(jié)因子，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)突觸發(fā)生和突觸連接的形成。在維甲酸處理下，SH-SY5Y細(xì)胞形成基本的軸突，但是在維甲酸-腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子聯(lián)合作用下，SH-SY5Y細(xì)胞分化并顯示出分子不對(duì)稱和大量神經(jīng)元標(biāo)記物的表達(dá)，維甲酸-腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的序貫調(diào)節(jié)導(dǎo)致了形態(tài)和分子的快速極化，模擬了真實(shí)神經(jīng)元的分化。

另外，Goldie等通過(guò)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的序貫調(diào)節(jié)分化誘導(dǎo)關(guān)鍵突觸基因，腦特異性miRNA和miRNA生物發(fā)生機(jī)制的表達(dá)以及乙酰膽堿酯酶活性增加，產(chǎn)生更多具有特征的成熟神經(jīng)元細(xì)胞群體。相比之下，僅由全反式維甲酸誘導(dǎo)的變化似乎在未成熟的神經(jīng)母細(xì)胞和成熟的神經(jīng)元之間產(chǎn)生了一種中間表型，并且可能是研究發(fā)育中神經(jīng)元的合適模擬物。而Strother等提出了一種新穎、簡(jiǎn)單、無(wú)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的技術(shù)，即使用維甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞分化，將SH-SY5Y細(xì)胞在含5-氟脫氧尿苷、鐵強(qiáng)化小牛血清或市售血清替代品(SR-2)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成了SH-SY5Y細(xì)胞的有效分化和長(zhǎng)期培養(yǎng)。

此外，在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，維甲酸和GLP-1可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化為形態(tài)和生理成熟的谷氨酸和多巴胺能神經(jīng)元。用維甲酸預(yù)處理然后進(jìn)行ECM凝膠培養(yǎng)，并結(jié)合腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白β1、NGF和維生素D3處理可產(chǎn)生與成人神經(jīng)元明顯相似的可持續(xù)細(xì)胞。SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)在層粘連蛋白包被的玻璃片上，用維甲酸處理后，顯示出良好的神經(jīng)元分化的形態(tài)，并強(qiáng)烈附著在玻片上(作為下游功能分析中穩(wěn)定的細(xì)胞間連接的一部分)，使其適合于研究突觸分子。

以人神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液為誘導(dǎo)劑，與維甲酸聯(lián)合誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化，SH-SY5Y細(xì)胞在3 d內(nèi)就足以產(chǎn)生神經(jīng)元，顯著縮短了SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)元分化所需的時(shí)間，而且能顯著提高SH-SY5Y細(xì)胞中神經(jīng)元的比例。利用與基質(zhì)細(xì)胞系PA6的共培養(yǎng)系統(tǒng)可以更容易，更快速地誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化為與成熟原代神經(jīng)元非常接近的特性，這種分化加快了速度，縮短了時(shí)間，能夠獲得足夠分化的細(xì)胞以供實(shí)驗(yàn)使用。

SH-SY5Y細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y是研究神經(jīng)退行性疾病的常用細(xì)胞系。神經(jīng)分化的SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，更適用于帕金森病、阿爾茨海默病等的生化、毒理學(xué)研究。

SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)帕金森病的應(yīng)用

帕金森病的特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡，魚(yú)藤酮、1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶( MPTP)和6-羥基多巴胺等毒素可引發(fā)與運(yùn)動(dòng)和行為改變相關(guān)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡，被廣泛應(yīng)用于帕金森病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?

SH-SY5Y細(xì)胞的未分化和分化兩種形式都被廣泛應(yīng)用于帕金森病的研究，但是哪種細(xì)胞是最合適的模型仍在爭(zhēng)論中。通過(guò)比較未分化的SH-SY5Y細(xì)胞和分化的SH-SY5Y細(xì)胞的大量神經(jīng)元標(biāo)志物，以及對(duì)帕金森病神經(jīng)毒素1-甲基-4苯基-吡啶離子和6-羥基多巴胺的反應(yīng)性，Cheung等發(fā)現(xiàn)未分化的SH-SY5Y細(xì)胞在維甲酸分化后多巴胺能特性沒(méi)有改變，但對(duì)帕金森神經(jīng)毒素的敏感性降低，因此認(rèn)為未分化的SH-SY5Y細(xì)胞可能更適合作為實(shí)驗(yàn)性帕金森病研究的模型。

而Lopes等將SH-SY5Y細(xì)胞維甲酸分化后，分化細(xì)胞在分化后第4天、第7天和第10天中神經(jīng)元標(biāo)志物酪氨酸羥化酶、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)元核蛋白的免疫含量明顯高于未分化細(xì)胞，在分化的第7天和第10天，對(duì)神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺的敏感性增加，因此認(rèn)為第7天維甲酸分化的SH-SY5Y細(xì)胞是研究帕金森病病理生理基礎(chǔ)的分子和細(xì)胞機(jī)制的更合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?

1-甲基-4苯基-吡啶離子或魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的毒性機(jī)制取決于不同的分化細(xì)胞類型，應(yīng)用維甲酸、佛波酯12-肉豆蔻13-醋酸酯和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分別分化為膽堿能乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)陽(yáng)性表型及多巴胺能TH陽(yáng)性表型。

氧化應(yīng)激在多巴胺能表型中占主導(dǎo)地位，而炎癥介質(zhì)在膽堿能表型中占主導(dǎo)地位，兩種分化細(xì)胞在暴露于線粒體毒素的情況下都表現(xiàn)出鈣蛋白酶的激活。有研究者認(rèn)為，維甲酸處理SH-SY5Y細(xì)胞誘導(dǎo)促進(jìn)一般神經(jīng)元樣表型和主要多巴胺能特征的分化程序。維甲酸分化的SH-SY5Y細(xì)胞能夠攝取1-甲基-4苯基-吡啶離子，很可能是通過(guò)多巴胺和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其模仿體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元攝取1-甲基-4苯基-吡啶離子，因此，檢測(cè)1-甲基-4苯基-吡啶離子在維甲酸分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞中的作用，可能會(huì)更準(zhǔn)確地模擬帕金森病腦中多巴胺能神經(jīng)元的線粒體功能障礙。

而另有研究者認(rèn)為，維甲酸+TPA誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞表現(xiàn)出更明顯的多巴胺能表型，表現(xiàn)出與體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元相似的1-甲基-4苯基-吡啶離子毒性特征。與維甲酸+TPA分化細(xì)胞相比，維甲酸分化細(xì)胞對(duì)多巴胺的攝取明顯減少，對(duì)1-甲基-4苯基-吡啶離子的毒性不敏感，且對(duì)1-甲基-4苯基-吡啶離子的毒性不受多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白阻滯劑的抑制。維甲酸+TPA分化的SH-SY5Y細(xì)胞為探索1-甲基-4苯基-吡啶離子引起的細(xì)胞死亡機(jī)制提供了一種更可行的模型。分化的SH-SY5Y細(xì)胞暴露于低劑量魚(yú)藤酮模型模擬了早期帕金森病的變化，可能有助于篩選該疾病階段的神經(jīng)保護(hù)療法，特別是那些可能防止突起回縮和路易神經(jīng)突起形成的初始病理的療法。

α-突觸核蛋白是帕金森病的主要成分。α-突觸核蛋白可以與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，減少底物攝取，調(diào)節(jié)多巴胺傳遞，從而影響神經(jīng)元功能。過(guò)表達(dá)的α-突觸核蛋白可以形成α-突觸核蛋白聚集體，誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡。在亞鐵存在的情況下，維甲酸和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子誘導(dǎo)神經(jīng)元分化促進(jìn)胞漿內(nèi)α-突觸核蛋白陽(yáng)性包涵體的形成，這些包涵體與人路易體有相同的基本免疫病理特征。Song等設(shè)計(jì)了表達(dá)人突變型A53T α-突觸核蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，證明了作為研究帕金森病突觸核蛋白異常聚集的細(xì)胞模型，SH-SY5Y細(xì)胞中類似突觸核蛋白異常調(diào)節(jié)通路的完整性。Vasquez等建立并鑒定了一個(gè)含有Tet-on SNCA cDNA盒的SH-SY5Y細(xì)胞系，它不僅避免了高水平的α-突觸核蛋白對(duì)分化的不利影響，而且允許在神經(jīng)元分化之前/之后有控制的、有條件的和可重復(fù)的α-突觸核蛋白的過(guò)度表達(dá)，與其他常規(guī)使用的細(xì)胞模型相比，這種可誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞系為帕金森病和其他帕金森病樣突觸病變提供了一個(gè)可靠和更相關(guān)的細(xì)胞模型。Pantazopoulou等研究了在誘導(dǎo)表達(dá)人α-突觸核蛋白神經(jīng)分化的SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，重組α-突觸核蛋白預(yù)制纖維(PFF)誘導(dǎo)α-突觸核蛋白組裝的周轉(zhuǎn)。這一成熟的細(xì)胞模型可以被證明是評(píng)估α-突觸核蛋白組件的聚集和周轉(zhuǎn)以及不同翻譯后修飾(即磷酸化、泛素化、截?cái)?、磺?；?的作用及其對(duì)寡聚化的影響的重要工具，并可以進(jìn)一步篩選影響α-突觸核蛋白聚集、清除、分泌和細(xì)胞間傳遞的修飾物。

SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)阿爾茨海默病的應(yīng)用

阿爾茨海默病的特點(diǎn)是認(rèn)知功能減退，并伴有膽堿能神經(jīng)元的特定變性。組織學(xué)上，阿爾茨海默病的主要病理特征有2個(gè)：神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣蛋白-β的細(xì)胞外沉積。阿爾茨海默病體外模型的一個(gè)重要特征是基于表達(dá)阿爾茨海默病相關(guān)基因的人膽堿能神經(jīng)元的產(chǎn)生，形成tau磷酸化及淀粉樣蛋白-β沉積病理生理學(xué)相似的體外模型有助于研究阿爾茨海默病疾病機(jī)制及篩選神經(jīng)保護(hù)藥物等。

維甲酸分化后，SH-SY5Y細(xì)胞獲得了膽堿能樣表型，適合作為研究淀粉樣蛋白-β暴露對(duì)膽堿能影響的細(xì)胞模型。在維甲酸+腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子處理的細(xì)胞中，我們觀察到膽堿能標(biāo)志物的高表達(dá)和酶活性。聯(lián)合使用亞致死劑量的岡田酸和可溶性淀粉樣蛋白-β寡聚體處理分化的SH-SY5Y細(xì)胞，提供了一種與最初受阿爾茨海默病影響的膽堿能神經(jīng)元的病理生理學(xué)相似的體外模型。二丁酰環(huán)磷腺苷對(duì)去甲腎上腺素能表型的處理和維甲酸+腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)膽堿能表型的處理增加了細(xì)胞對(duì)淀粉樣蛋白-β42毒性的易感性，二丁酰環(huán)磷腺苷分化和維甲酸+腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分化的SH-SH5Y細(xì)胞可能為進(jìn)一步研究淀粉樣蛋白-β的毒性機(jī)制以及篩選保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受淀粉樣蛋白-β毒性作用的化合物提供依據(jù)。

維甲酸+TPA分化的多巴胺能SH-SY5Y細(xì)胞具有對(duì)淀粉樣蛋白-β介導(dǎo)的毒性具有高度抗性的特點(diǎn)，維甲酸+TPA分化細(xì)胞可用于揭示淀粉樣蛋白-β耐受的機(jī)制，有助于更好地理解阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性變和神經(jīng)保護(hù)作用。閆宇輝等采用APP基因轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞模擬 淀粉樣蛋白-β沉積致阿爾茨海默病的細(xì)胞模型，進(jìn)而探究藥物的神經(jīng)保護(hù)作用。

在維甲酸+腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分化的SH-SY5Y細(xì)胞中，tau的含量和磷酸化狀態(tài)均增加，這與形態(tài)學(xué)上明顯的突起生長(zhǎng)一致。維甲酸+腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分化的SH-SY5Y細(xì)胞可作為研究tau磷酸化機(jī)制和篩選潛在的GSK3β抑制劑的合適模型。Agholme等將SH-SY5Y 細(xì)胞用維甲酸預(yù)處理，然后在培養(yǎng)基中加入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和VitD3的細(xì)胞外基質(zhì)凝膠培養(yǎng)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，顯示出成熟神經(jīng)元的形態(tài)和生化特征，tau的表達(dá)水平與成人大腦相當(dāng)，這種細(xì)胞體外模型可用于阿爾茨海默病的研究。

小結(jié)

SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)源于人骨髓，是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的亞克隆，通過(guò)不同的分化方法可以使SH-SY5Y細(xì)胞分化為更成熟的神經(jīng)元樣表型，表現(xiàn)出一系列極具指導(dǎo)性的神經(jīng)生物學(xué)特性，從而促進(jìn)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞和分子機(jī)制的研究。

SH-SY5Y細(xì)胞廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的實(shí)驗(yàn)研究，不同的分化導(dǎo)致細(xì)胞代謝和特定神經(jīng)元特征的差異，因此，不同的分化方案可使SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)不同的神經(jīng)元表型，且能讓SH-SY5Y細(xì)胞應(yīng)用于不同疾病病理生理機(jī)制研究的優(yōu)點(diǎn)和局限性表現(xiàn)出來(lái)，選擇分化方案顯得至關(guān)重要。

另外，基因方法也應(yīng)用于SH-SY5Y細(xì)胞的功能研究中，以靶向與疾病相關(guān)的一種或多種途徑。這些對(duì)不同的分化SH-SY5Y細(xì)胞模型的正確利用將更有利于神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制及疾病的藥物治療研究。

用于PARP-1依賴性程序性細(xì)胞死亡(Parthanatos)在布比卡因致SH-SY5Y細(xì)胞損傷中作用的研究

應(yīng)用SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP-1的表達(dá)、PAR含量變化及細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的變化,初步明確布比卡因所致的神經(jīng)毒性中是否存在Parthanatos;同時(shí)通過(guò)外源性NAD對(duì)布比卡因所致的細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加、線粒體膜電位降低、細(xì)胞核損傷及細(xì)胞凋亡的影響,確定外源性NAD是否有助于減輕布比卡因的神經(jīng)毒性。

其目的在于從新的角度探討在布比卡因神經(jīng)毒性的機(jī)制,為臨床上防治局麻藥的神經(jīng)毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第1章布比卡因神經(jīng)毒性是否與多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)激活有關(guān)目的明確布比卡因是否導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞PARP-1激活,其神經(jīng)毒性是否與激活PARP-1有關(guān)。

方法以1-10mM布比卡因培養(yǎng)液處理SH-SY5Y細(xì)胞30分鐘-6小時(shí),以Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP-1及其代謝產(chǎn)物-多聚腺苷二磷酸核糖(Poly-(ADP)ribose,PAR)的表達(dá)情況;以100nM、200nM的PARP-1抑制劑-PJ34培養(yǎng)液與5mM布比卡因培養(yǎng)液共同處理細(xì)胞30分鐘,或單獨(dú)以5mM布比卡因處理細(xì)胞30分鐘,光鏡下觀察其對(duì)布比卡因所致細(xì)胞形態(tài)改變的影響,并以CCK-8法其對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。不同濃度布比卡因處理30分鐘后細(xì)胞內(nèi)PARP-1及PAR的表達(dá)、1mM布比卡因處理0-6小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)PAPR-1及PAR的表達(dá)采用完全隨機(jī)單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊);PJ34對(duì)布比卡因處理后細(xì)胞存活率的影響采用兩因素析因設(shè)計(jì)資料方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’s T3法(方差不齊)。

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