原代人軟骨細(xì)胞簡介

軟骨組織由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成，人軟骨細(xì)胞就分離自軟骨組織。軟骨細(xì)胞位于軟骨陷窩內(nèi)。電鏡下，軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。

人軟骨細(xì)胞采用膠原酶-中性蛋白酶聯(lián)合消化制備而來，人軟骨細(xì)胞分離自軟骨組織;軟骨組織由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)及纖維構(gòu)成。軟骨組織再生能力強(qiáng)，這些增生的幼稚細(xì)胞形似纖維母細(xì)胞，以后逐漸變?yōu)檐浌悄讣?xì)胞，并形成軟骨基質(zhì)，細(xì)胞被埋在軟骨陷窩內(nèi)而變?yōu)殪o止的軟骨細(xì)胞。根據(jù)軟骨組織內(nèi)所含纖維成分的不同，可將軟骨分為透明軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨三種，其中以透明軟骨的分布較廣，結(jié)構(gòu)也較典型。軟骨細(xì)胞(chondrocyte)位于軟骨陷窩內(nèi)。幼稚的軟骨細(xì)胞位于軟骨組織的表層，單個分布，體積較小，呈橢圓形，長軸與軟骨表面平行，越向深層的軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形，細(xì)胞核圓形或卵圓形，染色淺，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，常見數(shù)量不一的脂滴。成熟的軟骨細(xì)胞多2-8個成群分布于軟骨陷窩內(nèi)，這些軟骨細(xì)胞由同一個母細(xì)胞分裂增殖而成，稱為同源細(xì)胞群。電鏡下，軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

原代人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法

人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：人原代軟骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1無菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

原代人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟

人軟骨細(xì)胞復(fù)蘇方法

將含有1 mL人軟骨原代細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。

在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。

然后將所有原代人軟骨細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜)。

第三天換液并檢查人原代軟骨細(xì)胞密度。

人軟骨細(xì)胞傳代方法

如果人軟骨原代細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

加入0.25%Trypsin-0.02% EDTA消化液于培養(yǎng)瓶中(T25瓶1-2ml，T75瓶2-3ml)，使消化液浸潤所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min(難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間)，然后在顯微鏡下觀察HC細(xì)胞消化情況，若HC細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加3-4ml完全培養(yǎng)基終止消化。

輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

將原代人軟骨細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含6-8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

HC人軟骨細(xì)胞凍存方法

待HC細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例;

a、收集HC細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)HC細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使人HC細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mLHC細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

HC人軟骨細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

HC人軟骨細(xì)胞為什么傳代后形態(tài)會發(fā)生變化?

軟骨細(xì)胞傳代后變形，可能是大多數(shù)老師在培養(yǎng)過程中都會遇到的問題。不過，傳代時形態(tài)發(fā)生變化，這是正常現(xiàn)象。下面詳解該細(xì)胞形態(tài)的變化過程：

第1代人軟骨細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多角形(僅供參考)

第2代的細(xì)胞形態(tài)

傳了1代后，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生改變，細(xì)胞伸出絲狀偽足，形態(tài)似成纖維細(xì)胞(如圖2)。

圖2. 第2代細(xì)胞狀態(tài)圖(僅供參考)

從第1代到第2代，細(xì)胞就發(fā)生了形態(tài)上的改變。那么，繼續(xù)傳代下去，細(xì)胞形態(tài)是否會繼續(xù)發(fā)生改變呢?

答案是肯定的。第3代的軟骨細(xì)胞形態(tài)成纖維化會更為明顯，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)長梭形，并且生長速度開始下降。4代后較為明顯，到第6代細(xì)胞形態(tài)幾乎全部變?yōu)殚L梭形，似成纖維細(xì)胞樣。所以，建議最好選擇2代或3代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

既然人軟骨細(xì)胞傳代時，形態(tài)會發(fā)生變化，那究竟是什么原因造成的呢?

在體外培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞時，軟骨細(xì)胞呈貼壁生長，原代細(xì)胞大多呈橢圓形和多角形。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞逐漸變成長梭形，向纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時，該細(xì)胞的功能也會發(fā)生變化：軟骨標(biāo)志性蛋白Ⅱ膠原合成分泌減少，而Ⅰ、Ⅲ型膠原合成分泌增多。

Ⅱ膠原的合成和分泌，是軟骨細(xì)胞維持其分化表型的特征性指標(biāo)，其在透明軟骨中占膠原的85%~90%，提供了軟骨特有的張力和硬度。

其次，軟骨中的其他分子與膠原蛋白結(jié)合，會形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使軟骨具有一定的彈性，同時對于維持軟骨形狀，承載外來負(fù)荷起著非常重要的作用。所以，隨著傳代次數(shù)的增加，維持細(xì)胞形態(tài)的物質(zhì)會逐漸減少，細(xì)胞的形態(tài)就會發(fā)生改變。

這種形態(tài)和功能的變化稱之為反分化現(xiàn)象，也是單層傳代細(xì)胞的普遍現(xiàn)象。

培養(yǎng)小貼士

1. 低密度培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞易發(fā)生去分化現(xiàn)象，一般最適接種密度為2~10×104/cm2;

2. 軟骨細(xì)胞代謝較為緩慢，換液頻度的增加無益于細(xì)胞的增殖，反而可能破壞由細(xì)胞分泌而形成的群體化學(xué)環(huán)境。

參考文獻(xiàn)

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原代人軟骨細(xì)胞功能

軟骨細(xì)胞具有合成和分泌基質(zhì)與纖維的功能。

HC人軟骨細(xì)胞文獻(xiàn)溯源

1972年始，迄今為止，關(guān)于人軟骨細(xì)胞(HC細(xì)胞)的文獻(xiàn)已有2005篇。

在pubmed數(shù)據(jù)庫中用“human chondrocyte cell line”搜索該關(guān)鍵詞，第一篇為1972年M T Corvol在Endocrinology.發(fā)表的“A pituitary growth-promoting factor for articular chondrocytes in monolayer culture”。

HC人軟骨細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

人軟骨細(xì)胞(HC)來源于正常的人關(guān)節(jié)軟骨，它們產(chǎn)生并維持軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)，包括II型膠原蛋白。在研究中，這些細(xì)胞是細(xì)胞重編程和分化的金標(biāo)準(zhǔn)對照。

針對HC的表型特征描述和觀察其分化為破骨細(xì)胞。

研究使用HC來描述細(xì)胞受體的分子生物學(xué)、信號級聯(lián)、細(xì)胞因子激活和基因調(diào)控。

HC涉及在炎癥性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和萊姆病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎)中看到的凋亡、細(xì)胞毒性和軟骨降解。

通過檢查剪切應(yīng)力和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效果，一些研究人員希望利用HC開發(fā)出治療侵蝕性關(guān)節(jié)病變的方法。

一些實(shí)驗(yàn)室利用HC研究單克隆抗體治療或針對關(guān)節(jié)炎治療的侵蝕性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的抑制。

因HC在潛在的臨床應(yīng)用中受到關(guān)注，因?yàn)镠C能粘附在醫(yī)療植入物上并滲透到用于軟骨再生的支架中。

細(xì)胞標(biāo)志物

Collagen Type II和Aggrecan，以及Sox9。還有CD73、CD105、CD146、Collagen Type I、Osteopontin、MMP-13和C3等。這些標(biāo)志物對于識別和研究軟骨細(xì)胞非常重要。