293T細(xì)胞背景介紹

293T細(xì)胞由HEK293細(xì)胞衍生而來，是SV40 largeT抗原穩(wěn)轉(zhuǎn)得到的細(xì)胞株，并含有SV40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動子區(qū)。許多含有SV40病毒復(fù)制起始位點(diǎn)的真核表達(dá)載體如pcDNA3.1，可以在293T細(xì)胞中復(fù)制，因此293T細(xì)胞廣泛應(yīng)用于病毒包裝。293T細(xì)胞也適用于研究外源基因的表達(dá)，首先它易被轉(zhuǎn)染，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)50%；其次它的蛋白表達(dá)水平高，轉(zhuǎn)染后2-3天用堿性磷酸酶分析可以比較容易地檢測到表達(dá)的蛋白。另外瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞是過表達(dá)蛋白并獲得細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式之一。

293T產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：293T，人胚腎細(xì)胞

細(xì)胞別稱：Hek293T; HEK-293T; HEK 293T; HEK-293-T; HEK 293 T; 293-T; 293 T; 293T; Human Embryonic Kidney 293T; 293tsA1609neo

種屬來源：人，女性

組織來源：腎

形態(tài)特征：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長

培養(yǎng)基：90% DMEM+10% FBS+PS

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-3216 DSMZ; ACC-635;中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫

傳代方法：1:2至1:3，每周 2-3次

倍增時間：~24-30 hours

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

生物安全等級：1

293t細(xì)胞形態(tài)

293T人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul；黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

293t細(xì)胞復(fù)蘇方法

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL293T人胚腎細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻293T人胚腎細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查293t細(xì)胞密度。

293T人胚腎細(xì)胞傳代操作步驟

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿293T人胚腎細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

4)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，293T人胚腎細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對293T細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

7)將裝有293T人胚腎細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

8) 確定293T人胚腎細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

293T人胚腎細(xì)胞凍存方法

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上)；傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出293T人胚腎細(xì)胞，在顯微鏡下觀察293T細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

293T人胚腎細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

293T人胚腎細(xì)胞凍存小貼士

若是不確定細(xì)胞的冷凍條件或者細(xì)胞比較特殊，在做冷凍保存的同時，也可以用10%DMSO+90%FBS凍存幾管，或者凍存后隔天在復(fù)蘇一管測試，以防止冷凍失敗。

293T人胚腎細(xì)胞特點(diǎn)

a.293t細(xì)胞貼壁能力比較弱：293T細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，但其貼壁能力比較弱，容易出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象。比如：運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗帯⒃谑覝貤l件下靜置時間過長、添加的培養(yǎng)基或其他試劑溫度過低、培養(yǎng)時細(xì)胞密度過高、細(xì)胞聚集時未吹散、加液吹打時觸碰了細(xì)胞表面等。

若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)將細(xì)胞盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若出現(xiàn)大片脫落的現(xiàn)象需要收集細(xì)胞重新消化吹散再接種。

b.細(xì)胞本身偏嗜酸性，培養(yǎng)基消耗較快：293T細(xì)胞在略偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)更好，在培養(yǎng)過程中需要時刻注意培養(yǎng)基的pH值。在細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時，細(xì)胞培養(yǎng)基的消耗速度較快，需要時刻觀察并及時換液。

c.細(xì)胞生長時聚集成島：293T細(xì)胞生長時呈島狀聚集生長，會逐步向外擴(kuò)散直到完全融合。

d.細(xì)胞聚集成團(tuán)之后很難再吹散：293T細(xì)胞傳代過程中一定要注意吹散細(xì)胞，同時接種的密度不可過高。密度過高容易使細(xì)胞抱團(tuán)，導(dǎo)致難以再次吹散，會在培養(yǎng)器皿中形成類似于球狀的聚集體貼壁生長。導(dǎo)致即使培養(yǎng)條件合適細(xì)胞也難以生長。

293T人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

1.到貨的293T細(xì)胞脫落，如何處理?

293T細(xì)胞因?yàn)橘N壁松散，若購買常溫細(xì)胞，收貨時有可能大部分細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡下找不到細(xì)胞，只能看到肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)，是正?，F(xiàn)象。

收到細(xì)胞后請先置于培養(yǎng)箱中穩(wěn)定4-6h后再進(jìn)行下一步處理，不建議放置培養(yǎng)箱過夜后處理。

處理步驟

a.將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，1000rpm離心4min收集細(xì)胞;

b.去掉上清，用PBS重懸細(xì)胞(以手搖離心管的方式重懸，不要用移液槍吹)，將細(xì)胞收集到一個離心管中，再次1000rpm離心4min;

c.去掉上清，加入1mL左右0.25%胰酶重懸細(xì)胞(還是以手搖離心管的方式混勻，不要吹細(xì)胞), 放入培養(yǎng)箱消化2min;

d.消化2min后，加入5mL完全培養(yǎng)基混勻終止消化，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞團(tuán)分散，1200rpm離心3min;

e.去掉上清，加入6mL左右細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)基混勻，視細(xì)胞量決定是1:2傳代還是1:3傳代(由于細(xì)胞運(yùn)輸有損傷，首次傳代建議比平時養(yǎng)密度稍高);

f.顯微鏡下觀察細(xì)胞是否有分散成單顆現(xiàn)象，若有明顯很大的細(xì)胞團(tuán)需要重復(fù)上述步驟二次消化;

g.第二天及時觀察細(xì)胞貼壁情況，若貼壁細(xì)胞量過多，造成細(xì)胞堆積，貼壁24h后再次傳代分瓶，若密度正常則繼續(xù)生長，不建議換液貼壁48h后換液去掉不能貼壁的細(xì)胞。

2.293T人胚腎細(xì)胞傳代后聚團(tuán)嚴(yán)重?

原因分析

a.胰酶消化操作不當(dāng)導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)。消化過度或吹打過猛導(dǎo)致細(xì)胞受傷嚴(yán)重，破損的細(xì)胞碎片容易粘連聚團(tuán)。

b.消化時293T細(xì)胞融合率太高，成片脫落，將不容易被吹散，容易聚團(tuán)。

c.鑒于293T細(xì)胞貼壁疏松，普通0.25%胰酶消化時間控制10s-40s(不同胰酶牌子消化時間不同);吹打動作輕柔，充分分散;細(xì)胞融合率達(dá)到80%-90%即可傳代，不可長的太滿。

d.細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的成分：一些細(xì)胞培養(yǎng)基的成分可能促進(jìn)細(xì)胞的聚集，例如含有過多的膠原蛋白或其他黏附蛋白。

e. 細(xì)胞質(zhì)粘附不良：有些細(xì)胞可能由于細(xì)胞表面蛋白或黏附分子的缺失導(dǎo)致粘附能力下降，從而容易聚集在一起。

f 培養(yǎng)條件不當(dāng)：細(xì)胞培養(yǎng)過程中的pH、溫度、氣體條件等因素如果不適當(dāng)可能會導(dǎo)致細(xì)胞聚集。

g. 感染或污染：細(xì)胞培養(yǎng)過程中的感染或污染可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生異常反應(yīng)，包括聚集在一起形成團(tuán)塊。

3.293T人胚腎細(xì)胞換了血清批次后聚團(tuán)嚴(yán)重?

原因分析

血清批次間存在差異。293T細(xì)胞本身有聚團(tuán)生長特性，但嚴(yán)重聚團(tuán)可能是由于受到血清里的某些因子刺激。

先用血清試用裝，試用效果好，可購買和血清試用裝批次相同的正裝，有效避免批間差對細(xì)胞的影響。

4.293T人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后凋亡嚴(yán)重?

在排查了方法步驟和轉(zhuǎn)染試劑，依然沒有改善的情況下，可排查一下轉(zhuǎn)染前的營養(yǎng)體系，尤其是血清批間差帶來的影響。前期培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)正常，其實(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)只是鑒別細(xì)胞是否健康的一個外在指標(biāo)，還要結(jié)合細(xì)胞其它指標(biāo)對細(xì)胞健康進(jìn)行評定(比如倍增時間，存活率)。

通過更換血清批次，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并觀察轉(zhuǎn)染后的效果，比較分析出原因。

5.293T人胚腎細(xì)胞培養(yǎng)要點(diǎn)

293T人胚腎細(xì)胞貼壁性較差，容易飄起來，37℃靜置可重新貼壁。換液時注意不要用力搖晃培養(yǎng)瓶，否則有可能會把細(xì)胞搖下來。

293T人胚腎細(xì)胞容易消化，消化下來的細(xì)胞容易成團(tuán)，要吹打吹散。否則傳代后細(xì)胞會成團(tuán)生長，不均勻，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

當(dāng)293T人胚腎細(xì)胞生長至匯合率達(dá)到80~90%需要對細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。

細(xì)胞貼壁松散，操作時應(yīng)輕拿輕放;PBS潤洗時動作應(yīng)緩慢，避免沖走細(xì)胞;

細(xì)胞傳代第二天可能有輕微聚團(tuán)現(xiàn)象，再長一天能長開，不建議傳代第二天換液，以免損失細(xì)胞。

隨著傳代的次數(shù)增加，293T細(xì)胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等情況。所以要在細(xì)胞購進(jìn)時就進(jìn)行大量凍存，以保證實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和持續(xù)性。

293和293t細(xì)胞區(qū)別

什么是 HEK293?

HEK293 是一種永生化細(xì)胞系，來源于人胚胎腎臟，用剪切的人腺病毒 5 型 DNA 轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生許多重組蛋白。HEK293 剛開始是由荷蘭生物學(xué)家 Alex Van der Eb 于 1973 年從人類腎臟細(xì)胞中分離出來的。這些細(xì)胞是在女性胎兒的組織培養(yǎng)物中生長的。后來，Van der Eb 實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員 Frank Graham 對它們進(jìn)行了剪切的人類腺病毒 5 型 DNA 轉(zhuǎn)染。該細(xì)胞系之所以被命名為HEK293，是因?yàn)檫@是弗蘭克的第293次實(shí)驗(yàn)。

將腺病毒基因整合到 HEK 細(xì)胞基因組中，使這些細(xì)胞能夠非常有效地產(chǎn)生大量重組蛋白。此外，腺病毒載體含有CMV啟動子區(qū);因此，它進(jìn)一步提高了效率。該細(xì)胞系已被用作基因表達(dá)研究的宿主。

什么是 HEK293t?

HEK293t是源自HEK293原始細(xì)胞系的子代細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染攜帶SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體，產(chǎn)生大量重組蛋白。HEK293t 是一種表達(dá) SV40 大 T 抗原突變體的人類細(xì)胞系。HEK293t 是在斯坦福大學(xué) Michele Carlos 的實(shí)驗(yàn)室通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HEK29E 細(xì)胞系和編碼 SV40 大 T 抗原的溫度敏感突變體的質(zhì)粒而創(chuàng)建的。它初被稱為 293/tsA1609neo。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染用于創(chuàng)建賦予新霉素抗性和 SV40 大 T 抗原的 tsA 1609 等位基因表達(dá)的細(xì)胞系。

由于 SV40 大 T 抗原的突變版本的表達(dá)，具有 SV 40 復(fù)制起點(diǎn)的轉(zhuǎn)染質(zhì)?？梢源蟠笤黾又亟M蛋白的量。該細(xì)胞系通常用于生物技術(shù)行業(yè)的蛋白質(zhì)表達(dá)和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)。

HEK293 和 HEK293t 的相同之處

轉(zhuǎn)染通常被定義為將外來DNA和RNA引入細(xì)胞以影響其基因型和表型的過程。通過各種生物、化學(xué)和物理方法引入外來核酸可以改變細(xì)胞的特性。這允許在細(xì)胞環(huán)境中研究基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)。HEK293 和 HEK293t 是兩種細(xì)胞系，由于它們具有轉(zhuǎn)染傾向，多年來在細(xì)胞生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。

HEK293 和 HEK293t 是兩種細(xì)胞系，由于它們具有轉(zhuǎn)染傾向，因此被廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)研究，兩者的相同之處在于：

兩種細(xì)胞系都是實(shí)驗(yàn)室衍生的。

這些細(xì)胞系可以大大增加重組蛋白的產(chǎn)量。

它們是通過用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胚胎人腎細(xì)胞制成的。

HEK293 和 HEK293t 的區(qū)別

HEK293 是一種永生化細(xì)胞系，來源于人類胚胎腎臟，該腎臟被剪切的人類腺病毒 5 型 DNA 轉(zhuǎn)染。相反，HEK293t 是源自 HEK293 原始細(xì)胞系的子細(xì)胞系，該細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了攜帶 SV40 復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體。因此，這是 HEK293 和 HEK293t 之間的主要區(qū)別。此外，HEK293 不表達(dá) SV40 大 T 抗原的突變版本。另一方面，HEK293t 表達(dá) SV40 大 T 抗原的突變版本。

293T細(xì)胞的應(yīng)用

作為一個稱職的“工具細(xì)胞”，293T細(xì)胞的應(yīng)用十分廣泛：慢病毒包裝生產(chǎn)及滴度測定，外源基因表達(dá)研究，蛋白表達(dá)研究，信號通路研究，抗體驗(yàn)證，藥物篩選，條件培養(yǎng)基制作等，可以說，293T細(xì)胞是許多細(xì)胞科研工作者的入門細(xì)胞。

CRISPR/Cas9技術(shù)在293T細(xì)胞中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)作為目前大熱的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)在293T細(xì)胞上得到了很好的應(yīng)用，通過精準(zhǔn)的基因編輯構(gòu)建各類工程細(xì)胞系從而用于研究細(xì)胞凋亡研究，功能基因組學(xué)，信號傳導(dǎo)途徑，藥物研發(fā)，藥物抗性機(jī)制，藥物反應(yīng)和細(xì)胞療法等。

CRISPR/Cas9技術(shù)在293T細(xì)胞中的具體案例

293T細(xì)胞助力研究PLAC8基因?qū)C細(xì)胞增殖和遷移的影響

癌基因胎盤特異性8(PLAC8)在細(xì)胞過程和人類疾病扮演著重要的角色，但對于PLAC8如何影響人腎癌(KC)細(xì)胞增殖和遷移的研究并不多。 因此Qin等人選擇293T細(xì)胞作為研究對象，研究PLAC8對293T細(xì)胞增殖和遷移產(chǎn)生的影響。首先他們通過CRISPR/Cas9建立了兩株P(guān)LAC8敲除(KO)293T細(xì)胞系，為了對293T細(xì)胞增殖和遷移過程中的PLAC8特征進(jìn)行分類，他們通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、集落形成實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞增殖活性)、細(xì)胞周期，劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移試驗(yàn)等表型實(shí)驗(yàn)(源井生物可提供各類表型實(shí)驗(yàn)服務(wù))，以及Westernblot對其分子機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，敲除PLAC8可抑制293T細(xì)胞增殖。此外，PLAC8-KO對293T細(xì)胞增殖的抑制作用與細(xì)胞周期中的G2/M相關(guān)，同時PLAC8-KO顯著抑制細(xì)胞周期蛋白B1和升高細(xì)胞周期蛋白a。這說明PLAC8在293T細(xì)胞增殖和遷移中起著重要的作用，并為進(jìn)一步研究PLAC8對人KC細(xì)胞的作用提供了重要的研究依據(jù)[1]。

293T細(xì)胞助力構(gòu)建重組蛋白生產(chǎn)量化模型

293T細(xì)胞表達(dá)外源基因的能力是有目共睹的，已被認(rèn)為是生產(chǎn)表達(dá)特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的強(qiáng)大工具，并被廣泛用于生產(chǎn)多種重組蛋白。然而，構(gòu)建的工程細(xì)胞系的重組蛋白產(chǎn)量往往不一致，并且難以量化。Lo等人使用 CRISPR/Cas9 將人核糖體蛋白 L13A ( RPL13A ) 敲入到特定位點(diǎn)(圖3)，這樣轉(zhuǎn)基因表達(dá)由內(nèi)源性啟動子驅(qū)動，以確保重組蛋白的一致和可預(yù)測的表達(dá)。還可通過從具有所需表達(dá)水平的基因中選擇啟動子來預(yù)先確定表達(dá)水平。為了量化重組蛋白的表達(dá)，蛋白質(zhì)定量報(bào)告基因 (PQR) 被整合在內(nèi)源基因和外源基因之間，PQR 等摩爾生產(chǎn)內(nèi)源性蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)和熒光報(bào)告基因，這樣就可用細(xì)胞的熒光強(qiáng)度量化目標(biāo)蛋白的表達(dá)[1]。

293T細(xì)胞助力端粒酶活性抑制機(jī)制研究

所有持續(xù)增殖的細(xì)胞，如干細(xì)胞和癌細(xì)胞，都有一種補(bǔ)償持續(xù)分裂過程中端粒磨損的機(jī)制。大多數(shù)情況下，這種要求是由端粒酶滿足的。體細(xì)胞由于缺乏端粒酶活性無法無限分裂，但當(dāng)細(xì)胞中TERT轉(zhuǎn)錄的重新激活后就會使它們能夠繼續(xù)分裂，這是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵步驟。因此，研究TERT表達(dá)對于了解端粒酶活性水平在生理和病理?xiàng)l件下的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。人類TERT基因啟動子區(qū)域的兩個點(diǎn)突變(C-124T和C-146T)在各種癌癥類型中高度復(fù)發(fā)，并且與較高的端粒酶水平相關(guān)。 Xi 等人使用 CRISPR/Cas9 修改內(nèi)源性TERT基因，用定位標(biāo)簽標(biāo)記內(nèi)源性 TERT 蛋白或。通過這種方法，他們生成了表達(dá) FLAG-SNAP 標(biāo)記的 TERT 蛋白的 293T細(xì)胞系，從而實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性 TERT 的有效免疫純化 (IP) 和亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，端粒酶在任何給定時間內(nèi)只定位于少數(shù)端粒。他們還生成了帶有修飾的TERT啟動子的HEK 293T 和 SCaBER 細(xì)胞，這表明去除C-124T突變足以降低端粒酶水平并縮短端粒。這種方法不僅為研究端粒酶生物學(xué)提供了有用的工具，而且還提供了一種通用方法來純化和可視化低豐度蛋白質(zhì)，以及在低編輯效率的基因組位點(diǎn)進(jìn)行單堿基對修飾[3]。

參考文獻(xiàn)

[1] Qin, Xu-Hui, et al. "Knockout of the placenta specific 8 gene affects the proliferation and migration of human embryonic kidney 293T cell." Cell biochemistry and biophysics 78.1 (2020): 55-64.

[2] Lo, Chiu-An, Alexander W. Greben, and Brian Edwin Chen. "Generating stable cell lines with quantifiable protein production using CRISPR/Cas9-mediated knock-in." BioTechniques 62.4 (2017): 165-174.

[3] Xi, Linghe, et al. "A novel two-step genome editing strategy with CRISPR-Cas9 provides new insights into telomerase action and TERT gene expression." Genome biology 16.1 (2015): 1-17.