小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞背景簡介

小皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離自腦皮層組織;皮層神經(jīng)元細(xì)胞是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元是具有長突觸(軸突)的細(xì)胞，它由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。在長的軸突上套有一層鞘，組成神經(jīng)纖維，它的末端的細(xì)小分支叫做神經(jīng)末梢。細(xì)胞體位于腦、脊髓和神經(jīng)節(jié)中，細(xì)胞突起可延伸至全身各器官和組織中。細(xì)胞體是細(xì)胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4-120微米。核大而圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)少，核仁明顯。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有斑塊狀的核外染色質(zhì)，還有許多神經(jīng)元纖維。細(xì)胞突起是由細(xì)胞體延伸出來的細(xì)長部分，又可分為樹突和軸突。每個神經(jīng)元可以有一或多個樹突，可以接受刺激并將興奮傳入細(xì)胞體。每個神經(jīng)元只有一個軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個神經(jīng)元或其他組織，如肌肉或腺體。皮質(zhì)神經(jīng)元是大腦皮質(zhì)的主要組成細(xì)胞之一，是大腦進(jìn)行功能活動調(diào)節(jié)的基本單位，參與動物多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。通過形態(tài)學(xué)觀察顯示神經(jīng)元從貼壁、伸出突起開始;突起逐漸增多，而后突起進(jìn)一步增多并逐漸成網(wǎng)，同時細(xì)胞胞體增大，周邊光暈明顯。10-12d細(xì)胞最為豐滿，隨后神經(jīng)元開始裂解，突起逐漸減少，細(xì)胞已退化變性，輪廓模糊，光暈消失，細(xì)胞變形。

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)所需試劑

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞貼壁培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞添加劑、皮層神經(jīng)元細(xì)胞組織分離液 、冰盤、HBSS緩沖液、胰酶、配好的dmem(500ml dmem+50ml 胎牛血清+5ml雙抗)

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)所需耗材

尖頭鑷、彎鑷、剪刀、10 cm培養(yǎng)皿、6 cm培養(yǎng)皿、70um細(xì)胞篩、臺盼藍(lán)、計數(shù)板

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離方法

提前開啟紫外線照射超凈臺30 分鐘。將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預(yù)溫10-30 分鐘。紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺，超凈臺通風(fēng)10 分鐘以上。

包板：將10x的多聚賴氨酸(PLL)稀釋成1x的工作液，每個六孔板加入2mL晃動，鋪滿底部。過夜，洗2-3次。

(消化前的步驟在冰盤上操作)

1. 準(zhǔn)備試劑：準(zhǔn)備5個10 cm培養(yǎng)皿，5個6 cm培養(yǎng)皿置于冰上，倒入HBSS

2. 取胎鼠：取E17.5天(14.5-17.5天 大了會有膠質(zhì)細(xì)胞)的孕鼠，處死后酒精消毒孕鼠，用手術(shù)剪剪開孕鼠腹部，將子宮取出，放入10 cm培養(yǎng)皿。

3. 洗子宮：將取出的子宮在剩余10 cm培養(yǎng)皿中洗3-4次，將胎鼠取出放入另一個10 cm培養(yǎng)皿。

4. 取腦子：用尖頭鑷剝離胎鼠頭部及腦殼，取出腦子黑色畫圈部分，放入6 cm培養(yǎng)皿

5. 剝腦膜：將一個腦移至一個新的6 cm培養(yǎng)皿(兩三個腦子用一個6 cm培養(yǎng)皿，防止太久HBSS升溫)，在解剖鏡下去除嗅球(綠色的部分)，小腦及兩個大腦半球中間的連接物，將剝干凈的皮層放入新的6 cm培養(yǎng)皿

6. 消化：全部剝完后，吸走HBSS，用鑷子夾碎腦袋，夾至漿糊狀，每個腦子加入1ml皮層神經(jīng)元細(xì)胞組織分離液，五個腦子一組，吹打均勻后，放入10 cm培養(yǎng)皿中，37℃消化12min(避免一個10 cm培養(yǎng)皿放入太多腦子，避免離心管消化，會導(dǎo)致消化不均勻)

7. 終止消化：立即加入等量的配好的貼壁培養(yǎng)基終止消化，用5mL槍頭吹打12下

8. 過篩：將終止消化后的溶液，用細(xì)胞篩過濾

9. 重懸：1000G離心5min，去除上清，以每個腦子加入1ml配好的貼壁培養(yǎng)基，重懸。

10. 計數(shù)：吹打均勻后，取10ul細(xì)胞稀釋液，10ul 0.4%臺盼藍(lán)染色，混勻，計數(shù)

11. 種板：每個六孔板，每孔1.0-1.2*10^6個，12孔板每孔5-6*10^5個，10 cm培養(yǎng)皿1.2-1.5*10^7

培養(yǎng)皿規(guī)格種板細(xì)胞量

十二孔板：5-6*10^5個/孔

六孔板：1.0-1.2*10^6個/孔

10 cm培養(yǎng)皿：1.2-1.5*10^7

12. 換液：種板4小時左右換液，此時用配好的神經(jīng)元專用培養(yǎng)基

13. 培養(yǎng)：每3天換一次液。

小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)觀察

皮層神經(jīng)元細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈神經(jīng)元細(xì)胞樣，細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞;屬于不增殖細(xì)胞群;

2. 標(biāo)志物鑒定

皮層神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。

3. 誘導(dǎo)實驗