小鼠成骨細(xì)胞背景介紹

小鼠成骨細(xì)胞分離自顱骨組織;顱骨位于脊柱上方，由23塊形狀和大小不同的扁骨和不規(guī)則骨組成。除下頜骨及舌骨外，其余各骨彼此借縫或軟骨牢固連結(jié)，起著保護(hù)和支持腦、感覺器官以及消化器和呼吸器的起始部分的作用。顱分腦顱和面顱兩部分。腦顱位于顱的后上部，內(nèi)有顱腔，容納腦，共8塊。面顱為顱的前下部分，包含眶、鼻腔、口腔等結(jié)構(gòu)，構(gòu)成面部的支架，共15塊。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。骨不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩;其后，成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨;破骨與成骨過程的平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵。成骨細(xì)胞培養(yǎng)不僅有助于了解骨形成機(jī)制、骨骼系統(tǒng)疾病的分子和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，也是藥物篩選、生物材料開發(fā)和生物工程研究的重要手段。

小鼠成骨細(xì)胞分離,培養(yǎng)及鑒定方法

試劑及工具

成骨細(xì)胞組織消化液1、成骨細(xì)胞組織消化液2、成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基、PBS磷酸緩沖液、雙抗(100 U/ml 青霉素， 100 μg/ml 鏈霉素)、兩性霉素b、6 cm、手術(shù)剪，尖頭鑷，顯微剪等解剖工具

小鼠成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)操作步驟

1.取出生(2-3天)小鼠3-5只，將其放入一個(gè)大培養(yǎng)皿中，并用70%乙醇消毒。

2.用大剪刀取下頭部，抓住頸背處的頭部，沿著顱底做一個(gè)小切口。使用鑷子小心地從頭骨上去除皮膚和腦組織。

4. 切掉下頜，刮掉顱骨邊緣周圍的任何多余的組織和軟骨。

5. 將顱骨切成兩半，放入6cm培養(yǎng)皿中; 用PBS清洗顱骨。

6. 對(duì)第二只動(dòng)物重復(fù)步驟 2-5。

7.將頭蓋骨在成骨細(xì)胞組織消化液2(1mL/顱骨)中，37°C孵育消化10分鐘。消化結(jié)束后棄去胰蛋白酶溶液; 在成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基中洗滌。

8. 棄完全培養(yǎng)基，加入成骨細(xì)胞組織消化液2(800μl/顱骨)，在37°C孵育30分鐘。(每10min吹打

9. 棄去消化液溶液，換成新鮮的成骨細(xì)胞組織消化液2，在37°C下繼續(xù)消化60分鐘。

10. 保留最終消化物并轉(zhuǎn)移到15mL離心管中。加入5 mL成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基。

11.在室溫下以1500×g離心5分鐘。棄去上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基(1ml /顱骨)中。合并細(xì)胞懸液。

12.將20 mL 成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基加入T75培養(yǎng)瓶，往培養(yǎng)瓶中加入1mL胞懸液。

13. 將培養(yǎng)瓶在 37°C/ 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到匯合，大約三天左右

小鼠成骨細(xì)胞鑒定

1.形態(tài)觀察

小鼠成骨細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多角形細(xì)胞，酶消化分離所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶， 24 h后細(xì)胞充分伸展，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形。

2. 染色鑒定

2.1堿性磷酸酶染色

第3代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色，成骨細(xì)胞胞膜及胞漿內(nèi)顆粒染色呈棕色或者咖啡色顆粒。

2.2茜素紅染色結(jié)果

第 3 代成骨細(xì)胞培養(yǎng) 21 d 后，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞匯合處呈現(xiàn)多層重疊生長，形成鈣結(jié)節(jié)的不透明區(qū)域，茜素紅染色后，鈣結(jié)節(jié)被染成橘紅色。