大鼠軟骨細(xì)胞簡介

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離自關(guān)節(jié)軟骨組織;關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，表面光滑、呈淡藍(lán)色、有光澤，它是由一種特殊的叫做致密結(jié)締組織的膠原纖維構(gòu)成的基本框架，這種框架呈半環(huán)形，類似拱形球門，其底端緊緊附著在下面的骨質(zhì)上，上端朝向關(guān)節(jié)面，這種結(jié)構(gòu)使關(guān)節(jié)軟骨緊緊與骨結(jié)合起來而不會掉下來，同時當(dāng)受到壓力時候，還可以有少許的變形，起到緩沖壓力的作用。在這些纖維之間，散在分布著軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細(xì)胞組成，這些軟骨細(xì)胞維持關(guān)節(jié)軟骨的正常代謝。

關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)支配，也沒有血管，其營養(yǎng)成分必須從關(guān)節(jié)液中取得，而其代謝廢物也必須排至關(guān)節(jié)液中，關(guān)節(jié)軟骨的這種營養(yǎng)代謝必須通過關(guān)節(jié)運(yùn)動，使關(guān)節(jié)軟骨不斷的受到壓力刺激才行，所以關(guān)節(jié)運(yùn)動對于維持關(guān)節(jié)軟骨的正常結(jié)構(gòu)起重要的作用。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi)。幼稚的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞位于關(guān)節(jié)軟骨組織的表層，單個分布、體積較小、呈橢圓形，長軸與關(guān)節(jié)軟骨表面平行，越向深層的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形，細(xì)胞核圓形或卵圓形、染色淺，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，常見數(shù)量不一的脂滴。

成熟的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞多2-8個成群分布于關(guān)節(jié)軟骨陷窩內(nèi)，這些關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞由同一個母細(xì)胞分裂增殖而成，稱為同源細(xì)胞群。電鏡下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有突起和皺褶，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體及少量的線粒體。在組織切片中，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細(xì)胞之間出現(xiàn)較大的腔隙。體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞對于研究其生理功能、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)主要試劑

PBS磷酸緩沖液、軟骨細(xì)胞組織消化液I、軟骨細(xì)胞組織消化液II、大鼠軟骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基、雙抗溶液、40μM細(xì)胞篩、培養(yǎng)皿、巴氏管、解剖工具等

大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定方法

大鼠關(guān)節(jié)軟骨分離培養(yǎng)步驟

D1

1.把新生鼠(5-6D)以腹面朝下的姿勢固定上，用針固定前腿。用剪刀和鉗子去除后腿上的皮膚和軟組織，使股骨脫位并丟棄軟組織；

2.使用手術(shù)刀將股骨頭、股骨髁和脛骨分離(圖2b)，并放置在PBS中。

關(guān)節(jié)軟骨看起來像一個規(guī)則的半透明小球體，而骨骼看起來是棕色的。

3.PBS沖洗兩次

4. 將軟骨片于10 mL組織消化液I中，在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

5. 吸出軟骨將其放入一個新的培養(yǎng)皿中。加入新鮮的10 mL組織消化液I中，在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

6. 用移液管攪拌組織碎片以分離軟組織。提取軟骨碎片，并將其放入一個新的培養(yǎng)皿中，加入10 mL消化液II，4 ℃，過夜消化。

D2

1.將10 mL含有殘留軟骨的消化液II放入一個15 mL的試管中。將溶液依次通過25、10、5、2毫升的巴斯德移液管，以分散任何細(xì)胞聚集物。這就產(chǎn)生了分離細(xì)胞的懸浮液。

3.將細(xì)胞懸液通過40μM細(xì)胞篩，然后室溫400g離心10 min，棄上清。

4.用5 mL PBS清洗并離心，然后用15 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀。

5.用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)軟骨細(xì)胞。為了檢測提取細(xì)胞的活力，進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，平均每只大鼠獲得106個軟骨細(xì)胞。

6.在培養(yǎng)皿上以8x103/cm2細(xì)胞的密度種板軟骨細(xì)胞。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

A. iMACs的培養(yǎng)(6-7D)

iMACs在第6-7天達(dá)到融合。培養(yǎng)2d后更換添加FCS的培養(yǎng)基。在第2、3、5、6d時，細(xì)胞狀態(tài)圖如圖2e-h所示。

大鼠肋軟骨的分離

D1

1.將大鼠置于固定臺，腹面朝上，用針固定前后腿。將皮膚從肚臍切開到胸骨，然后用剪刀和鉗子沿著肋骨切開(圖3a)。

2.切開橫膈肌，并清除胸腔內(nèi)的所有軟組織(即肺和心臟)(圖3b)。

3.用剪刀取出肋骨(圖3c)。放置于PBS中。用手術(shù)刀去除皮膚和軟組織。(圖3d)。

鈣化肋骨看起來呈棕色(圖3d)。

4.用PBS沖洗兩次。

5. 將肋軟骨片置于15 mL消化液I中，在37℃培養(yǎng)箱消化45 min。

6. 用移液管攪拌組織碎片以分離軟組織。提取軟骨碎片，并將其放入一個新的培養(yǎng)皿中，加入10 mL組織消化液II，在4℃，過夜消化。

D2

1.向500 mL培養(yǎng)基中加入50 ml FCS。

2.將15 mL含有殘留軟骨的組織消化液II放入一個15 mL的試管中。將溶液依次通過25、10、5、2毫升的巴斯德移液管，以分散任何細(xì)胞聚集物。這就產(chǎn)生了分離細(xì)胞的懸浮液(圖2d)。

3.將細(xì)胞懸液通過40μM細(xì)胞篩，然后室溫400g離心10 min，棄上清。

4.用10 mL PBS清洗并離心，然后用40 mL添加FCS的培養(yǎng)基重懸沉淀。

5.用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)軟骨細(xì)胞。為了檢測提取細(xì)胞的活力，進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，平均每只大鼠獲得106個軟骨細(xì)胞。

6.在培養(yǎng)皿上以25x103/cm2細(xì)胞的密度種板軟骨細(xì)胞。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。。

未成熟大鼠肋軟骨細(xì)胞在第6-7天達(dá)到融合。培養(yǎng)2d后更換添加FCS的培養(yǎng)基。在第6h、1、2、5d細(xì)胞狀態(tài)圖如圖3e-h所示。

大鼠軟骨細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)觀察

使用顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)。匯合的iMAC表現(xiàn)出典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)，圓形或多邊形，細(xì)胞質(zhì)呈顆粒狀

2. 標(biāo)志物鑒定

檢測iMACs原代培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞分化的主要標(biāo)志物，II型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)；

體外培養(yǎng)6d后的合成富含II型膠原蛋白和蛋白多糖的基質(zhì)，對II型膠原蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測，阿爾新藍(lán)染色確定ECM中存在蛋白多糖的基質(zhì)(硫酸化蛋白聚糖)