hPSC定向誘導(dǎo)三胚層實(shí)驗(yàn)(單層法)視頻教程

背景介紹

干細(xì)胞作為一種具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，是醫(yī)學(xué)研究上用來研究組織和器官再生、藥物篩選，調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換以及動物發(fā)育分子機(jī)制的良好模型。從2007年，3位科學(xué)家以“利用胚胎干細(xì)胞把特定基因改性引入實(shí)驗(yàn)鼠的原理”獲得“諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎”，到2012年日本山中伸彌博士因“發(fā)現(xiàn)成熟細(xì)胞可以被重新編程誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞及戈登爵士的克隆生物學(xué)發(fā)現(xiàn)”再次斬獲“諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎”無一不證明了“20世紀(jì)是藥物治療的時(shí)代，21世紀(jì)是細(xì)胞治療的時(shí)代”。

基于hPSC的多能干性，體外環(huán)境下，hPSC可以在多種細(xì)胞因子或小分子藥物的相互作用下，可分化形成內(nèi)、中、外3個胚層。進(jìn)而可以體外模擬人胚發(fā)育，構(gòu)建模擬標(biāo)準(zhǔn)化的人體細(xì)胞、組織和器官。同時(shí)非先啟動及特異性分化的胚層誘導(dǎo)也是驗(yàn)證hPSC分化能力的重要實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)驗(yàn)介紹

Tri-embryonic differentiation kit三胚層分化試劑盒提供了一種簡單的誘導(dǎo)方案，可使人胚胎干(ES)和誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞向三個胚層分化的能力 神經(jīng)性外胚層，中胚層和內(nèi)胚層。該試劑盒包括專門的單一體系培養(yǎng)基和基于單層誘導(dǎo)(無需形成EB)的方案，對每個胚層進(jìn)行平行的體外定向分化實(shí)驗(yàn)，在一周內(nèi)清楚地、可重復(fù)地建立三系分化潛力。

準(zhǔn)備工作

Stem&Easy 即用鋪板液鋪板12孔板、準(zhǔn)備好冷藏的Stem&Easy Planking solution，吸取6ml鋪板液，每孔加入500ul，十字搖勻后4度過夜冷藏或者常溫放置2小時(shí)后使用。

此步驟推薦產(chǎn)品

Stem&Easy系列：Planking Solution 32ml

階段1：hPSCs的培養(yǎng)及內(nèi)胚層的直接誘導(dǎo)-以IMMOCELL -ESC(H9)細(xì)胞系為例

1、取狀態(tài)良好，匯合度75-80%的ESC經(jīng) 常溫的DPBS洗滌1-2次后，用immocell hPSC 溫和消化液+RI 消化7-8分鐘后，用1ml hPSC完全培養(yǎng)基終止消化，收集于1.5ml離心管中。

2、取10ul細(xì)胞懸液加入臺盼藍(lán)，(不用觀測)測試細(xì)胞活力和數(shù)量，匯合度在8成的單個6孔板消化后細(xì)胞密度平均為100000，分別加入10ml DE d 抑制劑和20ml hPSC完全培養(yǎng)基+ROCK抑制劑稀釋到100000和50000個細(xì)胞左右。

3、準(zhǔn)備3個用Stem&Easy 即用鋪板液鋪板的常規(guī)12孔板(鋪板后需在4度過夜),在不破壞基質(zhì)的情況下小心吸取5-10孔的上清，盡管體系的不同細(xì)胞密度，但是每孔依舊加入2ml細(xì)胞懸液。

總的來說，內(nèi)胚層直接誘導(dǎo)的12孔板中有5孔誘導(dǎo)體系，而20ml稀釋的懸液體系有10孔，用于中、外胚層的誘導(dǎo)。

此步驟推薦產(chǎn)品

階段2：中胚層誘導(dǎo)及中、內(nèi)觀察

1、將上述接種好的細(xì)胞十字搖勻后，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱。其中內(nèi)胚層為優(yōu)化的直接誘導(dǎo)體系，從接種到成熟只要4天，成熟的內(nèi)胚層譜系細(xì)胞排列及其緊密。(如下)

2、中、外胚層的誘導(dǎo)體系和hPSC的E8培養(yǎng)體系差異過大，直接誘導(dǎo)細(xì)胞容易出現(xiàn)應(yīng)激而不貼壁，中胚層建議貼壁1D后開始誘導(dǎo)。

3、觀察未加誘導(dǎo)液細(xì)胞的生長狀態(tài)和克隆密度，貼壁1天后細(xì)胞克隆密度達(dá)到30%,可以進(jìn)行中胚層誘導(dǎo)。吸取上清的hPSC完胚后，用減血清DMEM/F12洗滌一遍后每孔加入1ml的MD differentiation Medium+ROCK抑制劑，中胚層誘導(dǎo)過程會有大量細(xì)胞漂浮，為正?，F(xiàn)象，約5天后中胚層細(xì)胞譜系達(dá)到70%的匯合率，細(xì)胞形態(tài)類似間充質(zhì)細(xì)胞，呈現(xiàn)纖維狀。(如下)

階段3:神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)

1、外胚層由神經(jīng)外胚層、神經(jīng)嵴(neural crest, NC)、顱基板(cranial placode, CP)和非神經(jīng)外胚層四種主要的外胚層譜系所組成，每個外胚層譜系誘導(dǎo)方案不同，本方案主要誘導(dǎo)NC外胚層。

2、在hPSC貼壁2天后細(xì)胞克隆密度達(dá)到60-70%,吸取上清的hPSC培養(yǎng)基，用減血清DMEM/F12洗滌一次后每孔加入2ml的NeuroED differentiation Medium+ROCK抑制劑及10ul的NC 補(bǔ)充液A和10ul的NC補(bǔ)充液B誘導(dǎo)2天向1階段外胚層譜系誘導(dǎo)。

3、1階段誘導(dǎo)結(jié)束后吸棄上清加入2ml的NeuroED differentiation Medium和8ul的NC補(bǔ)充液A,誘導(dǎo)6-12天，每兩天換液一次，6天后外胚層譜系細(xì)胞狀態(tài)呈現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞狀，且每天都有許多細(xì)胞漂浮，為正?，F(xiàn)象，按時(shí)換液即可。

系列/方案iPSCs細(xì)胞擴(kuò)增三胚層誘導(dǎo)其他試劑

誘導(dǎo)結(jié)果的q-PCR分析