原代小鼠心肌細(xì)胞簡(jiǎn)介

心臟是發(fā)育中的胎兒中第一個(gè)形成的器官，在胎兒和出生后發(fā)育期間，心肌細(xì)胞成為終末分化的肌肉細(xì)胞，通過(guò)間隙連接首尾相連允許協(xié)同收縮活動(dòng)。心肌細(xì)胞的收縮-松弛周期由肌膜去極化引發(fā)的，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的周期性增加和減少協(xié)調(diào)，并由肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+釋放和重親攝理持。

原代小鼠心肌細(xì)胞提取實(shí)驗(yàn)工具

無(wú)菌鑷子、無(wú)菌組織剪、細(xì)胞篩、錐形瓶、HBSS緩沖液、小鼠心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基、小鼠心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基、心肌細(xì)胞組織專用消化液2、心肌細(xì)胞組織專用消化液1、0.1%明膠、三抗、溴脫氧尿苷、培養(yǎng)皿。

小鼠心肌細(xì)胞分離操作過(guò)程

1.小鼠心肌細(xì)胞分離(第一天)提前開啟紫外線照射超凈臺(tái)30分鐘HBSS緩沖液預(yù)冷，紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺(tái)，超凈臺(tái)通風(fēng)10 分鐘以上；

2.取出生(2-3天)小鼠3-5只使用異氟烷將乳鼠麻醉，噴酒精全身消毒用滅菌工具取出跳動(dòng)的心臟并將心臟放入裝有4 mL預(yù)冷HBSS(三抗1：100稀釋使用，即100ml加1ml三抗)的6cm培養(yǎng)皿中注意盡快取出心臟，并迅速將它們放在冰上所有步驟都應(yīng)在冰上進(jìn)行；

3.取出心臟后多個(gè)心臟放入同一個(gè)培養(yǎng)皿旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿清洗心臟組織清洗后轉(zhuǎn)入新的裝有4 mL預(yù)冷HBSS的培養(yǎng)皿中繼續(xù)清洗取心室，大約心尖往上2/3處將組織轉(zhuǎn)入裝有HBSS的培養(yǎng)皿清洗完成以上步驟轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿，置于冰上將組織塊裝入離心管中加入預(yù)冷的心肌細(xì)胞組織專用消化液1，重懸組織塊使用手術(shù)剪將心臟剪成小于1mm3的組織塊做好標(biāo)記，放入4°C培養(yǎng)箱中過(guò)夜消化；

4.心肌細(xì)胞分離(第二天)提前開啟紫外線照射超凈臺(tái)30分鐘將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化使用前室溫中預(yù)溫10到30分鐘75%酒精消毒超凈臺(tái)超凈臺(tái)通風(fēng)10 分鐘以上，用0.1%明膠包被培養(yǎng)皿，以6孔板為例每孔加入1mL明膠浴液置入37°C培養(yǎng)箱孵育兩小時(shí)，吸棄明膠溶液再加入HBSS緩沖液清洗將過(guò)夜消化的組織消化液取出加入1mL酶抑制劑輕彈管壁重懸37°C培養(yǎng)箱孵育30分鐘棄去上清，加入5mL心肌細(xì)胞組織專用消化液2轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，將其封口置于培養(yǎng)箱170-220轉(zhuǎn)，攪拌45min充分研磨組織過(guò)70μM細(xì)胞篩加入5mL的培養(yǎng)基(不含血清)沖洗離心管過(guò)篩繼續(xù)室溫放置20-60分鐘置于離心機(jī)1500轉(zhuǎn) 離心5 min棄去上清加入20mL心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)(100ml培養(yǎng)基)基重懸將細(xì)胞懸液鋪于兩個(gè)10cm培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時(shí)預(yù)培養(yǎng)后，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿并從兩個(gè)10cm培養(yǎng)皿中收集含有上清液的心肌細(xì)胞。收集細(xì)胞懸液1500轉(zhuǎn) 離心5 min。

將細(xì)胞重懸于心肌細(xì)胞純化培養(yǎng)基(需要添加0.1mM BrdU)中，細(xì)胞懸液接種于明膠包被的六孔板中(2x105/孔)，24小時(shí)后換液，更換心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(需要添加0.1mM BrdU)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，更換心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基(不用添加BrdU)。此后每?jī)商旄鼡Q傳代培養(yǎng)基

小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察

心肌組織消化后所有心肌細(xì)胞均為圓形，培養(yǎng)2到3小時(shí)部分細(xì)胞開始貼壁12h后可見梭形細(xì)胞，細(xì)胞逐漸增大部分貼壁的細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)24h細(xì)胞幾乎全部貼壁，可見多角形細(xì)胞及較多細(xì)胞搏動(dòng)48h細(xì)胞形態(tài)為多角形或梭形細(xì)胞伸出的偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，鋪滿瓶底。

小鼠心肌細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)

逸漠實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠心肌細(xì)胞一般經(jīng)免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。