本視頻為廈門逸漠生物科技有限公司出品關(guān)于細(xì)胞凍存步驟指南，我們對(duì)每一步操作都做了演示，以便實(shí)驗(yàn)者更好地理解細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程。

細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺(tái)開燈通風(fēng)10min、用75%酒精擦拭臺(tái)面

細(xì)胞凍存所需試劑物品

細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶，PBS， 和無血清細(xì)胞凍存液

細(xì)胞凍存步驟

從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作；

第一步：將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入超凈工作臺(tái)，吸去上清，沿皿壁加入5ml PBS，輕洗細(xì)胞表面，洗去表面培養(yǎng)基，再將PBS吸去；

第二步：加入2ml胰酶，37℃消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否脫落，可輕拍使未脫落細(xì)胞脫落；

第三步：加入3ml 完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹散，移入15ml離心管中，1000rpm，離心5min；

第四步：取一定量的凍存管，打印標(biāo)簽，寫明細(xì)胞名稱，凍存日期，所用培養(yǎng)基，貼標(biāo)簽；

第五步：離心結(jié)束后，用75%的酒精噴管身后，放回工作臺(tái)中，吸去上清，取1ml無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，后移入貼好標(biāo)簽的凍存管中，用封口膜密封管口；

第六步：直接將細(xì)胞放入-80度冰箱中，24h后可移入液氮中保存；

注意事項(xiàng)

1.不同細(xì)胞消化時(shí)間有差異，以實(shí)際鏡檢結(jié)果為準(zhǔn)，大部分細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可中止消化，消化時(shí)間不宜過長；

2.應(yīng)選擇匯合度80%-90%左右，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行凍存操作，確保細(xì)胞凍存時(shí)狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細(xì)胞特性進(jìn)行調(diào)整；

3.我們使用的無血清細(xì)胞凍存液，可直接凍存細(xì)胞于-80度，無需程序降溫。