基本信息

英文標(biāo)題：Closely Related Mycobacterial Strains Demonstrate Contrasting Levels of Efficacy as Antitumor Vaccines and Are Processed for Major Histocompatibility Complex Class I Presentation by Multiple Routes in Dendritic Cells.

中文標(biāo)題：密切相關(guān)的分枝桿菌菌株作為抗腫瘤疫苗的效力對(duì)比顯著，并在樹(shù)突狀細(xì)胞中通過(guò)多條途徑被處理以進(jìn)行主要組織相容性復(fù)合體I類呈遞

發(fā)表期刊：《Infection and Immunity Infect. Immun.》

影響因子：2.9

作者單位：

應(yīng)用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室1和黑色素瘤生物學(xué)組，英國(guó)癌癥研究英國(guó)臨床中心，圣詹姆斯大學(xué)醫(yī)院，利茲，英國(guó)

作者信息：Eleanor J. Cheadle,Dearbhaile O’Donnell,Peter J. Selby, and Andrew M. Jackson

研究背景

本研究的背景集中在探索樹(shù)突狀細(xì)胞如何處理表達(dá)重組抗原的分枝桿菌，特別是在疫苗開(kāi)發(fā)中對(duì)抗感染和腫瘤的應(yīng)用。目前，已有研究將分枝桿菌改造以表達(dá)腫瘤抗原，用于疫苗研究，但對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞如何識(shí)別和呈遞這些抗原至MHC I類分子的機(jī)制尚不明確。本研究特別比較了兩種分枝桿菌：快速生長(zhǎng)的Mycobacterium smegmatis和慢速生長(zhǎng)的M. bovis BCG，它們都被工程化以表達(dá)特定的腫瘤抗原OVA257–264。研究發(fā)現(xiàn)，盡管兩種菌株均能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，但重組M. smegmatis引起的成熟程度更高。在抗原呈遞方面，重組M. smegmatis的抗原僅能在DC2.4細(xì)胞系上以O(shè)VA257–264形式在Kb分子上呈遞，而重組M. bovis BCG的抗原則能在所有類型的樹(shù)突狀細(xì)胞上呈遞，且這種呈遞依賴于蛋白酶體功能和新生MHC I類分子。這些結(jié)果首次證實(shí)了慢速生長(zhǎng)的M. bovis BCG載體化的抗原能夠被樹(shù)突狀細(xì)胞有效處理并在MHC I類分子上呈遞，而快速生長(zhǎng)的M. smegmatis載體化的抗原則不能，為重組微生物疫苗的開(kāi)發(fā)提供了重要的啟示。

研究方法

本研究中，研究者首先構(gòu)建了表達(dá)多表位OVApet的重組分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌BCG巴斯德株和快速生長(zhǎng)的分枝桿菌M. smegmatis，它們?cè)谔囟ǖ呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)。通過(guò)PCR技術(shù)合成OVApet，并將其克隆到分枝桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMOD8中，該載體在HSP60啟動(dòng)子控制下表達(dá)。接著，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將pMOD8-OVApet質(zhì)粒DNA導(dǎo)入M. bovis BCG和M. smegmatis，并在含有卡那霉素的7H11瓊脂上篩選重組克隆。研究者使用6至8周齡的C57BL/6雌性小鼠進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，通過(guò)皮下注射不同劑量的重組M. bovis BCG和M. smegmatis，并在免疫后挑戰(zhàn)B16-OVA腫瘤細(xì)胞系，以評(píng)估疫苗效力。同時(shí)，維持DC2.4樹(shù)突狀細(xì)胞系和B3Z雜交瘤細(xì)胞，用于后續(xù)的抗原呈遞實(shí)驗(yàn)。通過(guò)磁珠分離法從C57BL/6和TAP1-/-小鼠的骨髓和脾細(xì)胞中分離出樹(shù)突狀細(xì)胞前體，并在特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)成骨髓源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)。研究者還分析了細(xì)菌感染樹(shù)突狀細(xì)胞的表型變化，并通過(guò)與B3Z雜交瘤細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)評(píng)估樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)OVA表位的呈遞能力。此外，通過(guò)ELISA測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2的濃度，以及檢測(cè)細(xì)菌上清液中OVApet蛋白的濃度，以評(píng)估抗原表達(dá)和呈遞效率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1. 工程化分枝桿菌分泌多表位OVApet的表達(dá)與檢測(cè)。

結(jié)核分枝桿菌BCG(M. bovis BCG)和快速生長(zhǎng)的分枝桿菌(M. smegmatis)被工程化以分泌多表位蛋白OVApet。構(gòu)建的多表位蛋白OVApet旨在表達(dá)OVA257-264 H2-Kb結(jié)合表位，并將其置于M. bovis BCG的α抗原分泌信號(hào)序列下游，確保其能從細(xì)菌中分泌出來(lái)(A)。野生型M. bovis BCG(1)、M. bovis BCG-OVApet(2)、M. smegmatis(3)和M. smegmatis-OVApet(4)的裂解物在十二烷基硫酸鈉-16%還原聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用抗PK單克隆抗體探測(cè)，隨后使用生物素標(biāo)記的二抗和鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)OVApet的表達(dá)(圖1B)。-Ag代表α抗原。

圖2.M. bovis BCG-OVApet疫苗對(duì)B16-OVA腫瘤挑戰(zhàn)的保護(hù)效果優(yōu)于M. smegmatis-OVApet。

結(jié)核分枝桿菌BCG(M. bovis BCG)經(jīng)過(guò)工程化改造后能夠分泌多表位OVApet，與M. smegmatis-OVApet相比，在C57BL/6小鼠中顯示出更好的抗腫瘤保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)中，C57BL/6小鼠分別在第0、14和28天通過(guò)皮下注射的方式在腹股溝區(qū)域接種了不同劑量的M. bovis BCG-OVApet或野生型M. bovis BCG。到了第42天，小鼠在對(duì)側(cè)腹部皮下被挑戰(zhàn)性地注射了B16-OVA腫瘤細(xì)胞，之后每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，接種M. bovis BCG-OVApet的小鼠相較于接種M. smegmatis-OVApet的小鼠，腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示了更明顯的保護(hù)效果。此外，通過(guò)Kaplan-Meier曲線分析，進(jìn)一步證實(shí)了M. bovis BCG-OVApet在提高小鼠生存率方面的優(yōu)越性。

圖3. M. bovis BCG-OVApet和M. smegmatis-OVApet誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟表型。

M. bovis BCG-OVApet和M. smegmatis-OVApet均能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞表現(xiàn)出成熟表型。實(shí)驗(yàn)中，我們將每106個(gè)樹(shù)突狀細(xì)胞以10的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)感染M. bovis BCG-OVApet(灰色虛線)或M. smegmatis-OVApet(粗線)，或不進(jìn)行感染(細(xì)線)，持續(xù)2小時(shí)。之后，使用抗生素處理殺死剩余的細(xì)胞外細(xì)菌，并將樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)。樹(shù)突狀細(xì)胞隨后與結(jié)合了藻紅蛋白的抗體一起孵育，針對(duì)CD40、CD54、CD80、CD86、H2-Kb和I-Ab，并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。圖A顯示了DC2.4細(xì)胞表面的表達(dá)情況，圖B顯示了骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)表面的表達(dá)情況。

圖4. 樹(shù)突狀細(xì)胞呈遞重組分枝桿菌抗原。

樹(shù)突狀細(xì)胞能夠從重組分枝桿菌中呈遞抗原。實(shí)驗(yàn)中，DC2.4細(xì)胞(三角形)、骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC，正方形)和脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(圓形)分別與不同濃度的SIINFEKL肽共孵育2小時(shí)，洗滌后與B3Z雜交瘤細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)測(cè)量上清液中的IL-2產(chǎn)量來(lái)評(píng)估抗原呈遞(圖A)。不同的樹(shù)突狀細(xì)胞被感染以不同量的M. bovis BCG(圓形)、M. bovis BCG-OVApet(正方形)、M. smegmatis(圓形)或M. smegmatis-OVApet(三角形)，并與B3Z雜交瘤細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)測(cè)量IL-2的分泌來(lái)評(píng)估H2-Kb分子上SIINFEKL表位的呈遞。圖B顯示了樹(shù)突狀細(xì)胞系DC2.4的結(jié)果，圖C顯示了骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的結(jié)果，圖D顯示了CD11c陽(yáng)性脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞的結(jié)果。

圖5. 熱殺死的M. bovis BCG-OVApet和M. smegmatis-OVApet中的SIINFEKL不被呈遞在MHC I類分子上。

作者發(fā)現(xiàn)熱殺死的M. bovis BCG-OVApet和M. smegmatis-OVApet中的SIINFEKL表位不能在MHC I類分子上呈遞。實(shí)驗(yàn)中，作者將每105個(gè)DC2.4細(xì)胞(圖A和B)或BMDC(圖C和D)在96孔板中與活菌(實(shí)心正方形)或熱殺死(空心圓圈)的M. bovis BCG-OVApet(圖A和C)或M. smegmatis-OVApet(圖B和D)以1、10、50或100的感染復(fù)數(shù)(MOI)共孵育2小時(shí)，溫度為37°C。剩余的細(xì)胞外細(xì)菌通過(guò)200微克/毫升的阿米卡星處理2小時(shí)，溫度為37°C來(lái)殺死。之后，樹(shù)突狀細(xì)胞在PBS中洗滌，并與每105個(gè)B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)，溫度為37°C。上清液通過(guò)固相ELISA檢測(cè)IL-2的分泌。

圖6.蛋白酶體抑制劑乳環(huán)素和逆行運(yùn)輸抑制劑布雷菲德菌素A降低DC2.4細(xì)胞中重組細(xì)菌來(lái)源SIINFEKL的呈遞。

作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑乳環(huán)素和逆行運(yùn)輸抑制劑布雷菲德菌素A能夠減少DC2.4細(xì)胞中重組細(xì)菌來(lái)源SIINFEKL的呈遞。實(shí)驗(yàn)中，作者將每105個(gè)DC2.4細(xì)胞在96孔板中與M. bovis BCG-OVApet或M. smegmatis-OVApet以1、10、50或100的感染復(fù)數(shù)(MOI)共孵育2小時(shí)，溫度為37°C，或者與SIINFEKL肽共孵育。剩余的細(xì)胞外細(xì)菌通過(guò)200微克/毫升的阿米卡星處理2小時(shí)，溫度為37°C來(lái)殺死。樹(shù)突狀細(xì)胞隨后在PBS中洗滌，并與每105個(gè)B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)，溫度為37°C。上清液通過(guò)固相ELISA檢測(cè)IL-2的分泌。在某些情況下，樹(shù)突狀細(xì)胞先用10微米乳環(huán)素處理3小時(shí)(圖A)，或用1或5微克/毫升布雷菲德菌素A處理30分鐘(圖B)。樹(shù)突狀細(xì)胞在加入B3Z之前用1%的甲醛固定并徹底洗滌(圖B)。統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的呈遞減少用*表示(P < 0.05，學(xué)生t檢驗(yàn))。

圖7：MHC I類分子呈遞SIINFEKL不受乳環(huán)素抑制，在BMDC和脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞中部分獨(dú)立于TAP。

作者發(fā)現(xiàn)MHC I類分子呈遞的SIINFEKL不受蛋白酶體抑制劑乳環(huán)素的抑制，并且在骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)和脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞中部分獨(dú)立于TAP。實(shí)驗(yàn)中，作者將每105個(gè)BMDC用10微米乳環(huán)素處理3小時(shí)或不處理，然后在96孔板中與M. bovis BCG-OVApet以1、10、50或100的感染復(fù)數(shù)(MOI)共孵育2小時(shí)，溫度為37°C，或者與SIINFEKL肽共孵育。剩余的細(xì)胞外細(xì)菌通過(guò)200微克/毫升的阿米卡星處理2小時(shí)，溫度為37°C來(lái)殺死。樹(shù)突狀細(xì)胞隨后在PBS中洗滌，并與每105個(gè)B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)，溫度為37°C。上清液通過(guò)固相ELISA檢測(cè)IL-2的分泌(圖A)。作者還感染了來(lái)自C57BL/6或TAP1-/-小鼠的每105個(gè)BMDC(圖B和C)或脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(圖D)與M. bovis BCG-OVApet，或與SIINFEKL肽共孵育，SIINFEKL對(duì)B3Z細(xì)胞的呈遞如上所述。如果乳環(huán)素處理后呈遞顯著減少或使用TAP1-/-樹(shù)突狀細(xì)胞后呈遞顯著增加，用*表示(P < 0.05，學(xué)生t檢驗(yàn))。

圖8：經(jīng)乳環(huán)素處理和TAP1-/-樹(shù)突狀細(xì)胞能以相似效率呈遞SIINFEKL肽。

作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳環(huán)素處理的和TAP1-/-樹(shù)突狀細(xì)胞能夠以相似的效率呈遞SIINFEKL肽。實(shí)驗(yàn)中，作者將每105個(gè)經(jīng)10微米乳環(huán)素處理(實(shí)心正方形)或未經(jīng)處理(空心三角形)的C57BL/6 BMDC與不同濃度的SIINFEKL共孵育2小時(shí)，洗滌后與每105個(gè)B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)，溫度為37°C。圖A顯示了B3Z細(xì)胞上清液中IL-2的分泌情況。圖B顯示了C57BL/6 BMDC(實(shí)心正方形)和TAP1-/- BMDC(空心圓形)與不同濃度的SIINFEKL共孵育后，與B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)的IL-2分泌情況。圖C顯示了C57BL/6脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(實(shí)心正方形)和TAP1-/-脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞(空心圓形)與不同濃度的SIINFEKL共孵育后，與B3Z細(xì)胞共培養(yǎng)16小時(shí)的IL-2分泌情況。

研究結(jié)論

在本研究中，兩種重組分枝桿菌菌株——M. bovis BCG和M. smegmatis——被工程化以表達(dá)模型腫瘤抗原OVA257-264。研究發(fā)現(xiàn)，重組M. bovis BCG-OVApet能顯著保護(hù)小鼠免受B16-OVA腫瘤細(xì)胞的挑戰(zhàn)，而M. smegmatis-OVApet則未能提供這種保護(hù)。兩種菌株均能誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，但M. smegmatis引起的成熟程度更高。DC2.4細(xì)胞系能夠有效處理并呈遞來(lái)自兩種菌株的SIINFEKL表位，盡管M. bovis BCG的效率略高。相比之下，BMDC處理M. bovis BCG-OVApet的SIINFEKL效率低于DC2.4細(xì)胞，而對(duì)M. smegmatis-OVApet的SIINFEKL處理只在部分實(shí)驗(yàn)中觀察到。脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞能夠處理并呈遞M. bovis BCG-OVApet的SIINFEKL，但對(duì)M. smegmatis-OVApet的SIINFEKL則不能。此外，只有活菌分泌的表位才能在DC2.4細(xì)胞系和BMDC中通過(guò)MHC I類分子呈遞。在DC2.4細(xì)胞中，SIINFEKL的呈遞部分依賴于蛋白酶體和TAP功能，而在BMDC和脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞中，則不依賴于這些因素。即使在TAP1基因缺陷小鼠中，BMDC仍能處理并呈遞M. bovis BCG-OVApet的SIINFEKL，盡管效率有所下降。在某些實(shí)驗(yàn)中，TAP1基因缺陷小鼠的脾臟樹(shù)突狀細(xì)胞呈遞效率甚至高于野生型小鼠。這些結(jié)果揭示了M. bovis BCG載體化的抗原能夠在體外生成的樹(shù)突狀細(xì)胞中被有效處理并在MHC I類上呈遞，而M. smegmatis載體化的抗原則不能，為重組微生物疫苗的開(kāi)發(fā)提供了重要的啟示。