C2C12成肌細(xì)胞引言

C2C12是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆。C2C12細(xì)胞分化很快，容易形成可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白2(BMP-2)處理C2C12細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的分化途徑從成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成骨細(xì)胞。

C2C12作為研究肌肉理想的細(xì)胞模型，在實(shí)驗(yàn)研究中常誘導(dǎo)其分化為多核肌管。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，它是通過一種高度協(xié)調(diào)的序列程序來產(chǎn)生成熟的骨骼肌的過程。

C2C12成肌細(xì)胞是一種常見的細(xì)胞模型，用于研究肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的過程。這種細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以被誘導(dǎo)分化為肌管，模擬肌肉組織的形成。本實(shí)驗(yàn)旨在探討C2C12成肌細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為肌管的最佳條件和過程。

C2C12細(xì)胞成肌注意事項(xiàng)

細(xì)胞狀態(tài)直接影響著分化潛力，要想C2C12細(xì)胞分化做得好，首以下三點(diǎn)，需要留意

1.c2c12細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，容易分化，建議密度達(dá)70%時(shí)傳代;

2.不要讓細(xì)胞長(zhǎng)得太滿甚至開始融合，影響后續(xù)成肌分化率;

3.c2c12細(xì)胞消化完全后再吹打混勻，不要用槍頭把沒有消化好的細(xì)胞吹下來，以免細(xì)胞成團(tuán)。

C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成肌實(shí)驗(yàn)原理

成肌細(xì)胞分化的研究對(duì)理解肌肉細(xì)胞發(fā)育和修復(fù)(再生)是非常重要的。

低濃度的馬血清能夠有效刺激C2C12成肌細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化。

c2c12細(xì)胞培養(yǎng)條件

DMEM高糖+10%FBS+1%雙抗

c2c12細(xì)胞成肌實(shí)驗(yàn)需要具備哪些條件

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：DMEM+2%馬血清(注意：馬血清的質(zhì)量嚴(yán)重影響分化的分化，建議做復(fù)孔和不同馬血清梯度濃度)

1.傳代密度： 維持細(xì)胞濃度在1.5~10×105 viable cells/75 cm2;2~3天換液1次。

2.細(xì)胞代數(shù)：建議傳代 C5 內(nèi)開始實(shí)驗(yàn)

3.分化誘導(dǎo)密度：70-80% 傳代或加入分化培養(yǎng)基。(注意：實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)：細(xì)胞融合到100%，會(huì)嚴(yán)重影響成管細(xì)胞的形成)

4.設(shè)置復(fù)孔：剛開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議設(shè)立誘導(dǎo) 4天、6天、8天、10天、12天 這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察，每天顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)， 拍照存圖。一般8-9天達(dá)到高峰。約有40%分化成熟的肌管，往后細(xì)胞逐漸衰老凋亡(注意：每天換液時(shí)需預(yù)熱分化培養(yǎng)基，并輕柔沿壁加入，避免沖起細(xì)胞。)

5.盡可能在皿里培養(yǎng)，且使用明膠在進(jìn)行包被，減少誘導(dǎo)過程中細(xì)胞漂浮的情況。

C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化肌管實(shí)驗(yàn)流程

待c2c12細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為80%左右時(shí)，即可進(jìn)行誘導(dǎo)分化。具體步驟如下:

1.丟棄舊培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次；

2.換分化培養(yǎng)基(高糖DMEM+2%馬血清+1% P/S)誘導(dǎo)，然后置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

3.每24h換液一次，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。誘導(dǎo)分化成功時(shí)，可以看見肌管表現(xiàn)為厚的管狀結(jié)構(gòu)，有時(shí)為多核。

4.在誘導(dǎo)分化的過程中，通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并分別在0h、24h、48h、72h收集細(xì)胞樣本，用Western blot檢測(cè)肌肉特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

C2C12細(xì)胞成肌小貼士

c2c12細(xì)胞代數(shù)不要太高；

若加入分化培養(yǎng)基后，細(xì)胞仍然繼續(xù)生長(zhǎng)，可用吉姆薩染色驗(yàn)證是否有分化了的肌纖維；

成肌分化過程中會(huì)有少量細(xì)胞凋亡，屬于正?，F(xiàn)象。

C2C12細(xì)胞分化成功指標(biāo)

1. 可通過吉姆薩Gimsa染色并顯微鏡下觀察

2. 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞肌性蛋白分子表達(dá)

3. 使用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞肌性mRNA分子表達(dá)，結(jié)蛋白desmin、成肌分化抗原myod、生肌素myogenin、肌球蛋白mysin等在分化過程中表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

C2C12細(xì)胞結(jié)果與分析

1.細(xì)胞形態(tài)變化

在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，C2C12成肌細(xì)胞的形態(tài)逐漸發(fā)生變化，由原來的扁平形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮位驁A形，這是肌管形成的典型形態(tài)學(xué)特征。

2.肌肉特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)分化的時(shí)間延長(zhǎng)，肌肉特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平逐漸升高。這表明C2C12成肌細(xì)胞在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，逐漸分化為具有肌肉特性的細(xì)胞。

C2C12細(xì)胞討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過使用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，成功地使C2C12成肌細(xì)胞在體外分化為肌管。結(jié)果表明，該細(xì)胞系在適當(dāng)?shù)臈l件下具有分化為肌肉組織的潛能。這對(duì)于研究肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也為未來的再生醫(yī)學(xué)研究提供了新的思路。

C2C12細(xì)胞成肌參考文獻(xiàn)

[1]張琳. EPA和DHA對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖,分化和凋亡的影響[D]. 武漢輕工大學(xué), 2018.