免疫熒光(immunofluorescence technic)Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)(fluorescentantibodytechnique)?！∮脽晒饪贵w示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。

細(xì)胞免疫熒光原理

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上，與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

直接法

將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體(第一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

細(xì)胞免役熒光準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料

1.抗體：根據(jù)需要使用的抗體，可以選擇合適的抗體。

2.細(xì)胞：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇合適的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并在37℃5%C02的培養(yǎng)箱條件下保持培養(yǎng)，直到實(shí)驗(yàn)需要。

3.用于洗滌細(xì)胞的生理鹽水或PBS緩沖液：使用無(wú)菌的生理鹽水或PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，可以保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境影響。

4.收集細(xì)胞：如酶標(biāo)記或其他標(biāo)記，獲得細(xì)胞膜豐度，收集細(xì)胞進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)，以確定最終實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量。

5.熒光染料：根據(jù)需要，選擇合適的熒光染料，按指定的比例混合，配制成熒光染料溶液備用。

細(xì)胞免役熒光固定和滲透化處理

1.使用適當(dāng)?shù)木彌_液(如甲醛)或有機(jī)溶劑(如甲醇)將細(xì)胞/組織進(jìn)行固定處理。

2.在室溫或低溫下，將緩沖液中的固定液置于載玻片或孔板中，進(jìn)行固定處理。

3.固定后，用洗滌緩沖液(如PBS)洗滌細(xì)胞/組織，去除多余的固定液。

4.在細(xì)胞內(nèi)透明化的同時(shí)，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。

細(xì)胞免役熒光抗體染色

1.準(zhǔn)備合適的一抗和二抗。一抗是特異性與待檢測(cè)蛋白結(jié)合的抗體，二抗是帶有熒光染料的抗體。

2.將一抗稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋⒓尤氲捷d玻片或孔板中，與細(xì)胞孵育。

3.將載玻片或孔板中的一抗與細(xì)胞孵育30-60分鐘，使抗體與待檢測(cè)的蛋白相結(jié)合。

4.在恰當(dāng)?shù)南礈炀彌_液中洗滌載玻片或孔板，去除多余的一抗。

5.同樣的方法，添加二抗到載玻片或孔板中，并孵育30-60分鐘，使二抗與一抗結(jié)合。

6.再次使用洗滌緩沖液洗滌載玻片或孔板，去除多余的二抗。

細(xì)胞免役熒光顯微鏡觀察

1.利用適當(dāng)?shù)娘@微鏡鏡頭，觀察載玻片或孔板上的細(xì)胞，并選取合適的區(qū)域進(jìn)行觀察。

2.使用適當(dāng)?shù)臒晒鉃V波片，觀察細(xì)胞中的熒光信號(hào)。

3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要，進(jìn)行圖像記錄和分析。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)是一種常見的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可以用于研究細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)和定位，提供有關(guān)蛋

白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的空間分布和功能的信息。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨罂赡軙?huì)有一些細(xì)微的差異，因此可以根

據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整或優(yōu)化步驟。

細(xì)胞免役熒光技術(shù)應(yīng)用

檢測(cè)靶蛋白如內(nèi)分泌激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物。

細(xì)胞免役熒光常見問(wèn)題

1.怎樣選擇二抗標(biāo)記的熒光

A: 二抗標(biāo)記的熒光顏色的選擇非常重要，要求在實(shí)驗(yàn)前根據(jù)現(xiàn)有材料和儀器的局限性設(shè)計(jì)好實(shí)驗(yàn)方案，一般我們進(jìn)行三種顏色的標(biāo)記工作。目前細(xì)胞核染料常用PI(紅色)或DAPI(藍(lán)色)，如果細(xì)胞中還表達(dá)EGFP(綠色)，則需要選用其他顏色的熒光素來(lái)標(biāo)記目的蛋白，不得已的情況下采用顏色相近，后期也要用光譜拆分技術(shù)對(duì)圖片進(jìn)行處理(需專業(yè)人員進(jìn)行，不建議采用相近顏色)。

2.怎樣選擇細(xì)胞免疫化學(xué)爬片所用的固定劑?

用甲醇，強(qiáng)烈脫水變性蛋白，并可溶解脂類物質(zhì)產(chǎn)生通透效應(yīng);蛋白變性完全，對(duì)抗原的保存性好，能充分暴露出抗原，無(wú)需通透處理不易保存細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞可能呈扁平狀。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)抗原、酶類抗原交聯(lián)劑用多聚甲醛，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)分子相互連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并維持在原位上，更易于保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)交聯(lián)產(chǎn)生的阻礙可能會(huì)降低細(xì)胞組分的抗原性，需要通透處理細(xì)胞膜相關(guān)組分蛋白。

3.做細(xì)胞免疫熒光大概提供多少抗體合適?

A：細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)我們需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)采用普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條件后再進(jìn)行Confocal拍攝的正式實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)條件后再進(jìn)行Confocal拍攝的正式實(shí)驗(yàn)。24孔板的細(xì)胞爬片在進(jìn)行一抗37℃孵育時(shí)，一般加入200ul經(jīng)BSA稀釋的一抗，其稀釋倍數(shù)需參考抗體說(shuō)明書，如稀釋倍數(shù)為1：100則每張爬片需要2ul(進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光的一抗稀釋倍數(shù)要比WB的小)。注意提供的抗體量需滿足預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)所需的量。

4.激光共聚膠顯微鏡拍攝除用于細(xì)胞免疫熒光拍攝外還可以進(jìn)行哪些檢測(cè)?

A：由于各種熒光標(biāo)記探針的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)熒光探針?lè)植己蜔晒鈴?qiáng)度的分析，Confocal實(shí)驗(yàn)還可以用于進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)游離鈣、線粒體膜電位、活性氧、細(xì)胞膜流動(dòng)性、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果的拍攝和分析工作。根據(jù)客戶對(duì)細(xì)胞處理的要求并且購(gòu)買合適的探針試劑盒，我們也可以為您進(jìn)行您實(shí)驗(yàn)所需的Confocal拍攝工作。