細(xì)胞傳代是將某一細(xì)胞系在一定的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的增殖后，把培養(yǎng)的細(xì)胞分離出來(lái)，重新種植到新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，進(jìn)行新一輪的培養(yǎng)，以達(dá)到無(wú)限次增殖的目的。細(xì)胞傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止，且也會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于細(xì)胞生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。因此，細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后就需要將其稀釋，分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。

細(xì)胞傳代作為一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作，不但可以擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量，同時(shí)也可以避免細(xì)胞因進(jìn)入平臺(tái)期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。我們知道細(xì)胞生長(zhǎng)一般經(jīng)歷4個(gè)時(shí)期：潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期和衰亡期。所以為了讓細(xì)胞保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，維持細(xì)胞旺盛的分裂能力，這時(shí)候就需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。

細(xì)胞傳代操作步驟及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

不同類型細(xì)胞傳代方法

細(xì)胞傳代要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，并且根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法：

貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用消化法傳代。

部分貼壁生長(zhǎng)但貼壁不牢固的細(xì)胞，可以采用直接吹打傳代。

懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，可以采用直接吹打或離心沉淀后再分離傳代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打傳代。

材料和器材

材料：培養(yǎng)瓶/皿，離心管，移液管，移液器，廢液缸，75%酒精，所需培養(yǎng)細(xì)胞

藥品：培養(yǎng)基，小牛血清或胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS緩沖液，青鏈霉素雙抗

儀器：CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，超凈臺(tái)

貼壁細(xì)胞的消化法傳代方法

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 -3min(視細(xì)胞消化情況而定)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

3.將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

溫馨提示：吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔不要用力過(guò)猛，同時(shí)盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都會(huì)對(duì)細(xì)胞有損傷。細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。

懸浮細(xì)胞的傳代方法

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心3-5min分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

半懸浮細(xì)胞的傳代方法

1.收集細(xì)胞培養(yǎng)上清：抽出瓶中的培養(yǎng)基和懸浮的細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清，細(xì)胞重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中(加入按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基)。

2.剩下貼壁的細(xì)胞，用不含鈣、鎂離子的PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1次。

3.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3 min(視細(xì)胞消化情況而定)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，加少量培養(yǎng)基終止消化。

4.按3mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻吹下細(xì)胞后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

5.將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中。

細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

在細(xì)胞傳代的過(guò)程中，需要注意以下幾個(gè)方面

1.無(wú)菌環(huán)境

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前要注意無(wú)菌環(huán)境的建立，紫外殺毒滅菌，酒精消毒都是十分有必要的。

2.鏡下檢查

鏡下檢查結(jié)果非常重要，鏡檢的結(jié)果非常重要，要根據(jù)你自己的觀察進(jìn)行細(xì)胞密度的識(shí)別，從而進(jìn)行細(xì)胞傳代比例的確定，進(jìn)行更好的細(xì)胞數(shù)量的控制，如果實(shí)驗(yàn)要求比較高，需要細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

3.過(guò)火焰

記住，所有開(kāi)瓶的東西都要進(jìn)行過(guò)酒精燈外焰，瞬間高溫進(jìn)行灰塵的固定。這樣會(huì)大大減少染菌幾率。

4.移液工具

很多人對(duì)于移液工具都有偏好，不好說(shuō)什么就是正確的。但是從無(wú)菌角度。使用移液管比微量移液槍減少污染的幾率要高。希望大家能用移液管。

5.交叉污染

混勻細(xì)胞懸液和移取培養(yǎng)基以及血清的工具要分開(kāi);還有就是胰酶和血清也要嚴(yán)格分開(kāi)，否則容易造成交叉感染，使細(xì)胞增加染菌幾率。

6.消化時(shí)間

對(duì)于貼壁細(xì)胞，我想要大家注意的是胰酶消化時(shí)間，對(duì)于常用0.25%的胰酶最好把消化時(shí)間控制在30s內(nèi)，必要是最好鏡檢看一下是否脫壁。但是這是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)活，要多積累經(jīng)驗(yàn)。

7.細(xì)胞混勻

在操作細(xì)胞傳代前，應(yīng)先熟悉細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)，例如細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備、培養(yǎng)材料和培養(yǎng)方法，以便為細(xì)胞傳代提供良好的培養(yǎng)條件。此外，應(yīng)及時(shí)記錄細(xì)胞傳代的情況，以便掌握細(xì)胞傳代過(guò)程的變化情況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和解決問(wèn)題。

傳代培養(yǎng)幾乎是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)到一定密度都會(huì)因?yàn)榻佑|抑制而停止生長(zhǎng)，之后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需，但培養(yǎng)皿中的細(xì)胞很容易受到外界污染，培養(yǎng)液是營(yíng)養(yǎng)富集的液體，可以支持細(xì)胞在其中生長(zhǎng)，然而，水能載舟亦能覆舟，“好喝”的營(yíng)養(yǎng)液，使得細(xì)菌們也能在培養(yǎng)液中快樂(lè)生長(zhǎng)，同時(shí)離體培養(yǎng)的細(xì)胞也是各類病毒、支原體等的大愛(ài)，因此，需要周全保護(hù)細(xì)胞“寶寶”們，以下所有操作要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無(wú)菌操作。

細(xì)胞傳代是一個(gè)復(fù)雜而關(guān)鍵的過(guò)程，在操作時(shí)必須格外謹(jǐn)慎，以免出現(xiàn)意外情況。只有在熟悉細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)的基礎(chǔ)上，注意上述注意事項(xiàng)，才能夠順利完成細(xì)胞傳代。