LMH雞肝癌細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

LMH雞肝癌細(xì)胞系是于1981年由Tomoyuki Kitagawa在日本東京都渡島區(qū)Kami Ikebukuro癌癥研究所建立的一種原發(fā)性肝細(xì)胞癌上皮細(xì)胞系。該細(xì)胞系癌組織來(lái)源于通過(guò)二乙基亞硝胺的長(zhǎng)期治療的Leghorn雞肝臟中誘發(fā)的腫瘤結(jié)節(jié)。LMH細(xì)胞表達(dá)葡萄糖-6-磷酸酶和微弱的微觀ATP酶活性，含有低水平的功能性雌激素受體，可誘導(dǎo)肝臟特異性載脂蛋白II(apoII)基因的表達(dá)。LMH細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。

LMH雞肝癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：LMH，雞肝癌細(xì)胞

種屬來(lái)源：雞

組織來(lái)源：肝

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-2117;BCRC; 60320BCRJ; 0361;CCLV; CCLV-RIE 0417;CLS; 601411;JCRB; JCRB0237;NCBI_Iran; C592;

培養(yǎng)基：DMEM/F-12+10% FBS(特級(jí)胎牛血清)+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：39℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

LMH雞肝癌細(xì)胞形態(tài)特征

LMH細(xì)胞的形態(tài)是上皮細(xì)胞(樹(shù)狀)，并且具有貼壁生長(zhǎng)的特性，但其貼壁能力較差。這種細(xì)胞表達(dá)葡萄糖-6-磷酸酶和微弱的小管ATP酶活性，能夠在無(wú)胸腺裸鼠中形成腫瘤。此外，LMH細(xì)胞含有低水平的功能性雌激素受體，并且可誘導(dǎo)肝特異性載脂蛋白II(apoII)基因的表達(dá)。這些特性使得LMH細(xì)胞系成為一種有用的工具，可用于轉(zhuǎn)染研究。

LMH細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng)步驟

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3. 器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM/F-12培養(yǎng)基、FBS特級(jí)胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

LMH細(xì)胞復(fù)蘇操作

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái) 30min，提前打開(kāi)水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放 30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mLLMH細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻LMH細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定LMH細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過(guò)夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

LMH細(xì)胞傳代操作

1) )從培養(yǎng)箱拿出LMH細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

2)打開(kāi)廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

3)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

4)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有LMH細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無(wú)菌離心管中。

5)將裝有LMH細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻LMH細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

6) 確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

LMH雞肝癌細(xì)胞傳代小貼士

LMH細(xì)胞貼壁性差，培養(yǎng)前需提前準(zhǔn)備好用0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶或使用Corning的cellbind細(xì)胞培養(yǎng)瓶。操作時(shí)不要沖刷到細(xì)胞層，2-3天換液，90%以上匯合度傳代。

LMH雞肝癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出LMH細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

LMH雞肝癌細(xì)胞細(xì)胞凍存步驟

a.收集LMH細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80 度凍存盒里，放置 24 小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

LMH雞肝癌細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

1.LMH細(xì)胞不貼壁?

LMH細(xì)胞細(xì)胞貼壁性差，培養(yǎng)前需提前準(zhǔn)備好用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶或使用Corning的cellbind細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

2.LMH雞肝癌細(xì)胞如何包被?

多聚賴氨酸包被方法

0.0025mg/ml-0.1mg/ml多聚賴氨酸，37℃ 5分鐘以上(培養(yǎng)箱15分鐘左右就行)或常溫過(guò)夜(6cm皿2ml 10cm皿4-5ml)。每株細(xì)胞對(duì)多聚賴氨酸耐受不一樣，因多聚賴氨酸有細(xì)胞毒性，在不影響貼壁的情況下，盡量低濃度使用。包被好，用pbs清洗三次后使用。

明膠包被方法

明膠不用洗，培養(yǎng)液浸泡三十分鐘，吸掉液體后，直接用

明膠多久需要換一次，每次鋪都要包被，一次一換

3.多聚賴氨酸可以重復(fù)使用嗎?

可以。但是一般不超過(guò)三次。

4.培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)LMH細(xì)胞回縮或增殖較慢?

可提高5%-10%血清比例，用39°培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5.LMH細(xì)胞消化時(shí)間為多久?

LMH細(xì)胞較易消化，培養(yǎng)箱消化2分鐘左右。

6.LMH細(xì)胞復(fù)蘇出現(xiàn)空泡 部分不貼壁 細(xì)胞干癟？

分析原因

a. 營(yíng)養(yǎng)不夠或血清不適應(yīng)，該細(xì)胞對(duì)血清要求較高，建議使用特級(jí)胎牛血清培養(yǎng)。

b. 多聚賴氨酸濃度過(guò)高或包被過(guò)久，多聚賴氨酸有細(xì)胞毒性。

c. 凍存細(xì)胞，復(fù)蘇狀態(tài)差

d. 消化過(guò)度

整改措施

a. 考慮復(fù)蘇狀態(tài)差，提高5%血清，未有改善，增殖很慢，細(xì)胞很瘦，不展開(kāi)。

b. 用PBS稀釋1倍多聚賴氨酸(0.1mg/ml)濃度，減少包被時(shí)間(培養(yǎng)箱5-10分鐘)。重新復(fù)蘇1株細(xì)胞后，細(xì)胞狀態(tài)良好。

LMH雞肝癌細(xì)胞應(yīng)用

LMH雞肝癌細(xì)胞系可以用于禽腺病毒4型弱毒株ON1的生物學(xué)特性及其免疫效力初步評(píng)價(jià)

為了研發(fā)用于HHS防控的FAdV-4弱毒活疫苗,本研究對(duì)分離自健康雞的FAdV-4毒株ON1的生物學(xué)特性和體外增殖規(guī)律以及對(duì)FAdV-4中國(guó)流行株強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)效果進(jìn)行了研究,以期為進(jìn)一步研發(fā)用于防控HHS的弱毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。

研究?jī)?nèi)容包括以下2個(gè)方面

1. FAdV-4弱毒株ON1的生物學(xué)特性研究為了解FAdV-4毒株ON1的生物學(xué)特性,利用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR和病毒滴度測(cè)定方法,研究該毒株在LMH雞肝癌細(xì)胞系中的生長(zhǎng)特性和增殖規(guī)律。

結(jié)果顯示FAdV-4毒株ON1在LMH中能夠很好增殖,呈現(xiàn)典型的腺病毒感染細(xì)胞病變,不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度與病毒基因組拷貝數(shù)呈正相關(guān),病毒感染后72 h時(shí)滴度最高,且培養(yǎng)上清中亦含有大量成熟的病毒粒子;將FAdV-4毒株ON1經(jīng)口感染7日齡SPF雞,所有感染雞臨床沒(méi)有任何癥狀;ON1感染雞在感染后12小時(shí)可從泄殖腔分離出病毒,2周的觀察期內(nèi)可持續(xù)檢測(cè)到排毒;采集感染雞的組織器官制備病理切片進(jìn)行HE染色,結(jié)果顯示ON1感染雞各組織器官與未感染對(duì)照雞沒(méi)有明顯差異。證明毒株ON1臨床上對(duì)雞不具有致病性。

2. FAdV-4弱毒株ON1的免疫原性和免疫效力為評(píng)價(jià)FAdV-4毒株ON1的免疫原性,本試驗(yàn)利用LMH雞肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)FAdV-4毒株ON1,將60只7日齡SPF雞隨機(jī)分為兩組,經(jīng)口服感染FAdV-4 ON1毒株,免疫后在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)ON1毒株免疫雞的FAdV-4特異性抗體水平,分析其免疫原性,同時(shí)采集泄殖腔拭子檢測(cè)免疫雞的排毒情況。

結(jié)果顯示,ON1免疫雞均產(chǎn)生FAdV-4特異性抗體和中和抗體,抗體水平在免疫后2周達(dá)到高峰期,并維持較長(zhǎng)時(shí)間。ON1免疫雞在感染后2周的觀察期內(nèi)持續(xù)排毒,病毒的排毒持續(xù)期與誘導(dǎo)的抗體水平相一致。在免疫后2周使用FAdV-4中國(guó)流行強(qiáng)毒株攻毒,以評(píng)價(jià)弱毒疫苗的免疫效力。

結(jié)果顯示,ON1免疫后2周用FAdV-4中國(guó)流行株強(qiáng)毒株攻毒,ON1免疫可以對(duì)FAdV-4中國(guó)流行強(qiáng)毒株提供75%保護(hù),而對(duì)照組雞全部死亡。結(jié)果表明FAdV-4 ON1毒株免疫可以對(duì)FAdV-4中國(guó)流行強(qiáng)毒株的攻擊提供部分保護(hù)作用。

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