今天推薦的是由科羅拉多大學(xué)健康科學(xué)中心牙科學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)和口腔研究系在1997年1月18日發(fā)表于In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal(2021IF：2.1001，JCRQ1)的一篇文章，通訊作者是J.T.TURNER教授，研究主要闡述了SV40永久化大鼠腮腺腺癌細(xì)胞株的開發(fā)與特征描述。

研究背景

使用含有猿猴病毒(SV40)基因組的質(zhì)粒，通過CaPO4沉淀法轉(zhuǎn)染大鼠腮腺唾液腺凋亡細(xì)胞。在30個克隆細(xì)胞系中，有2個細(xì)胞系被證明具有中度細(xì)胞分化和唾液腺胰腺細(xì)胞功能。對這兩種細(xì)胞系進行的功能研究表明，腎上腺素能激動劑(異丙腎上腺素)、血管活性腸肽前列腺素E和福斯可林能有效促進細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷3':5'-環(huán)單磷酸的產(chǎn)生。苯腎上腺素、氨甲酰膽堿能有效增加磷酸肌醇的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)游離鈣的水平，而物質(zhì)則會影響細(xì)胞內(nèi)游離鈣的產(chǎn)生。通過間接免疫熒光分析，兩種細(xì)胞系都表達(dá)了SV40大T細(xì)胞。電子顯微鏡評估記錄了中高水平的細(xì)胞分化，包括維持連接復(fù)合體、細(xì)胞極化、存在適量分泌顆粒。兩種細(xì)胞系的倍增時間分別為22小時和36小時。

摘要部分

過去幾年中，在確定大鼠唾液腺尖突細(xì)胞無血清原代培養(yǎng)對營養(yǎng)、激素、氧氣和生長的要求方面取得了重大進展。維持尖腺細(xì)胞細(xì)胞分化和正常分泌功能所必需的重要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白已經(jīng)確定。在無血清條件下，在35%02和5%CO2的環(huán)境中，在含有層粘連蛋白的重組大鼠尾膠原凝膠上培養(yǎng)大鼠唾液腺尖頭細(xì)胞，在培養(yǎng)的前15天，尖頭細(xì)胞能夠維持中等水平的細(xì)胞分化和功能。然而，到了第22天，細(xì)胞分化水平下降，出現(xiàn)了嚴(yán)重的細(xì)胞死亡。唾液腺研究的主要障礙之一是無法繁殖大量相同的、分化良好的尖腺細(xì)胞用于體外研究。建立具有高度細(xì)胞分化和接近正常尖狀體功能的永生化細(xì)胞系對于許多唾液腺尖狀體細(xì)胞和分子生物學(xué)的體外研究至關(guān)重要。在過去幾年中，有幾種不同的方法被用于開發(fā)永生化大鼠唾液腺細(xì)胞系(Patton和Wellner，1993年;Prasad等人，1994年)。年輕的成年大鼠腮腺唾液腺細(xì)胞在原代培養(yǎng)中生長。用pSVaneo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨后經(jīng)過新霉素抗生素選擇，培育出永生化細(xì)胞系。在本報告中，研究人員使用了以前用于建立人類上皮細(xì)胞系的pSVori-質(zhì)粒構(gòu)建體(Gruenert等人，1988年;Quissell，1997年)。研究人員并沒有利用抗生素選擇來鑒定單個細(xì)胞系，而是建立了一個選擇性篩選來鑒定分化良好的克隆細(xì)胞系，以防止轉(zhuǎn)染高分化尖頂細(xì)胞后可能出現(xiàn)的損失，因為高分化尖頂細(xì)胞對選擇性抗生素的毒性更敏感。如果沒有細(xì)胞外基質(zhì)作為基質(zhì)，未轉(zhuǎn)染的成年大鼠胰腺細(xì)胞無法在體外存活，也無法在塑料上存活(Quissell等人，1994年)。因此，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的最初幾個階段都是在細(xì)胞外基質(zhì)上維持的，以便細(xì)胞在塑料上生長之前有時間適應(yīng)(Quissell等人，1997年)。此外，每個細(xì)胞系都是在轉(zhuǎn)染后幾個階段才進行克隆的，這樣可以讓永生化細(xì)胞在進行克隆選擇和在塑料上培養(yǎng)之前進一步適應(yīng)和選擇。

材料方法

1.使用起源缺陷的SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠腮腺泌乳素細(xì)胞

通過一系列實驗轉(zhuǎn)染大鼠腮腺腺泡細(xì)胞，分離出30個不同的細(xì)胞克隆;其中11個克隆細(xì)胞系細(xì)胞角蛋白1-8呈陽性，19個克隆細(xì)胞系波形蛋白呈陽性。后一種細(xì)胞系被舍棄。隨后分析了剩余的11個細(xì)胞系對各種分泌物的[Ca2+]i遷移反應(yīng)。

圖1A是大鼠腮腺細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后兩代和克隆前在絲裂霉素C處理過的3T3成纖維細(xì)胞上生長的相位對比顯微照片。圖1A給出了上皮細(xì)胞典型的鵝卵石模式，大多數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系都表現(xiàn)出這種模式。只有那些波形蛋白陽性(即來源于成纖維細(xì)胞)的細(xì)胞系沒有表現(xiàn)出這種生長模式。這種鵝卵石外觀甚至出現(xiàn)在上皮細(xì)胞系中，后來證明這些細(xì)胞系的分化程度很低。圖1B是對轉(zhuǎn)染后的大鼠腮腺細(xì)胞進行免疫熒光分析以檢測SV40大T抗原的例子。轉(zhuǎn)染和克隆后檢測的所有細(xì)胞系在SV40大T抗原表達(dá)方面均呈陽性。如圖1B所示，SV40大T抗原的水平因細(xì)胞而異，但由于SV40大T抗原的轉(zhuǎn)化活性，SV40表達(dá)的主要亞細(xì)胞區(qū)是細(xì)胞核。

圖1.使用起源缺陷的SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠腮腺泌乳素細(xì)胞

2.初步篩選

在分離出克隆上皮細(xì)胞系后，研究人員利用篩選程序來確定并開始描述那些由分化良好的尖突細(xì)胞組成的細(xì)胞系。研究人員發(fā)現(xiàn)，通過分析[Ca2+]i的變化來確定單個克隆細(xì)胞對各種激動劑刺激的反應(yīng)，是一種有效而快速的方法，可用于識別具有合理細(xì)胞和功能分化水平的細(xì)胞系。圖2A展示了使用新鮮分散的大鼠腮腺唾液腺細(xì)胞進行典型研究的結(jié)果。這些細(xì)胞受到P物質(zhì)刺激后，細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化幅度總是最大的。氨甲酰膽堿(一種毒蕈堿膽堿受體激動劑)和去甲腎上腺素(通過腎上腺素受體)的反應(yīng)較低，但始終可以測量到，約為基礎(chǔ)值的三至四倍。ATP在剛分散的細(xì)胞中產(chǎn)生的反應(yīng)較小，但可重復(fù)。

在對單個細(xì)胞系進行永生化和鑒定之后，單個細(xì)胞系對這些激動劑的反應(yīng)各不相同，而且差異極大。在測試的任何單個細(xì)胞系中，研究人員都無法證明由P物質(zhì)受體引起的[Ca2+]i反應(yīng)。許多上皮細(xì)胞系在膽堿能和/或ct腎上腺素能受體刺激后也沒有表現(xiàn)出反應(yīng)。只有兩個克隆腮腺尖狀腺細(xì)胞系(C5和C10)表現(xiàn)出明顯的膽堿能和腎上腺素能受體介導(dǎo)的反應(yīng)，如圖2(B和C組)所示。除了對P物質(zhì)的反應(yīng)消失外，這兩種細(xì)胞系對ATP的最大[Ca2+]i反應(yīng)也急劇增加。

作為初步篩選程序的一部分，研究人員測定了細(xì)胞系對β-腎上腺素能受體異丙腎上腺素的反應(yīng)性。幾乎所有上皮細(xì)胞系對異丙腎上腺素的反應(yīng)都是細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平的增被他加。不過，不同細(xì)胞系的反應(yīng)程度差異很大。無論細(xì)胞系的分化程度如何，β-腎上腺素能受體偶聯(lián)腺苷酸環(huán)化酶反應(yīng)系統(tǒng)都保持完整。因此，β-腎上腺素能受體的活性似乎不是分化的鑒別指標(biāo)。

為了評估每種細(xì)胞系的細(xì)胞分化程度，研究人員都進行了光鏡和電子顯微鏡研究。那些沒有對膽堿能和鄰腎上腺素能激動劑表現(xiàn)出充分的受體介導(dǎo)的[Ca2+]i動員反應(yīng)的上皮細(xì)胞系也表現(xiàn)出較低的細(xì)胞分化水平。在已建立的30個細(xì)胞系中，有2個細(xì)胞系根據(jù)形態(tài)和功能標(biāo)準(zhǔn)被證明具有合理的細(xì)胞分化水平。研究人員對這兩種細(xì)胞系進行了以下研究：C5和C10。

圖2.使用H&L儀器觀察分泌物對裝載fura-2/AM的細(xì)胞中[Ca2+]i的影響

3.克隆腮腺腺泡細(xì)胞系(C5和C10)的表征

兩種細(xì)胞系的細(xì)胞都生長在蓋玻片上，然后浸泡在2.5%戊二醛和0.1M NaH2PO4 pH7.4中的0.1M蔗糖中90分鐘，用緩沖液洗滌三次，在Millonigs緩沖液中的1%OsO4中后固定1小時，用乙醇和環(huán)氧丙烷脫水，包埋在Medcast中。通過光學(xué)顯微鏡觀察(未圖示)，轉(zhuǎn)染20次后固定的C5主要由兩到四層豐滿的細(xì)胞組成，其中含有散在的、密度適中的分泌顆粒。偶爾有細(xì)胞群形成微囊，伸入培養(yǎng)基中。C10在轉(zhuǎn)染16個傳代后固定，已形成由立方體和豐滿細(xì)胞組成的單層細(xì)胞，偶爾含有中等密度的分泌顆粒。

細(xì)胞系C5和ClO的超微結(jié)構(gòu)(圖3-5)在許多方面都很相似。幾乎所有細(xì)胞都含有數(shù)量適中的分泌顆粒，具有雙相(電子致密和透明)亞結(jié)構(gòu)和中等至大量粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以及許多游離核糖體。外滲過程中的分泌顆粒很少見。這兩個樣本的細(xì)胞在內(nèi)側(cè)表面通過由緊密連接、中間連接(其中一些類似于間隙連接)和半球體組成的三方連接復(fù)合體相互連接。緊靠內(nèi)側(cè)質(zhì)膜下方的末端網(wǎng)(由微絲組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu))連接著緊密連接。在有絲分裂過程中看到的所有細(xì)胞都含有分泌顆粒和大量粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

C5和Cl0之間也有一些明顯的差異。在C5中，幾個細(xì)胞層之間有許多從內(nèi)側(cè)表面侵入的管腔狀細(xì)胞間隙，由三部分連接復(fù)合體封閉，并鑲有微絨毛。再看光鏡下的微囊，面向空腔的細(xì)胞表面有鈍突，由脫膜小體連接，而不是緊密連接。面向介質(zhì)的細(xì)胞外表面則由緊密連接體連接，并鑲有細(xì)長的微絨毛。這些觀察結(jié)果表明，微囊腔是細(xì)胞外空間，已擴大到許多內(nèi)襯細(xì)胞變薄的程度，這顯然是液體積聚的結(jié)果。另一方面，ClO大多為單層，內(nèi)側(cè)表面沒有管腔狀的細(xì)胞間延伸，底部的細(xì)胞外基質(zhì)要厚得多。

由于SpexCMlTllI雙激發(fā)分光熒光儀的靈敏度和反應(yīng)能力更強，因此研究人員使用它來進一步鑒定這兩種克隆細(xì)胞系。圖6顯示了兩種細(xì)胞系對不同濃度的毒蕈堿、膽堿能和P2-嘌呤能受體激動劑的反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)證實了研究人員最初的觀察結(jié)果，即細(xì)胞在原代培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和永生化后，P,介導(dǎo)的反應(yīng)增強。如圖6所示，兩種細(xì)胞系對所測試的各種激動劑都給出了相似的劑量-反應(yīng)模式。此外，兩種細(xì)胞系對ATP和尿苷-5'-三磷酸(UTP)的劑量-反應(yīng)曲線相等，這表明介導(dǎo)這些效應(yīng)的嘌呤受體屬于Pzu亞型，研究人員中的一位最近克隆并表達(dá)了這種受體，而且人類下頜下腺細(xì)胞系HSG-PA中也存在這種受體。

先前的研究表明，Pzu-嘌呤能、毒蕈堿能、膽堿能和a-腎上腺素能受體是大量細(xì)胞表面受體的代表，它們與肌醇磷脂特異性磷脂酶C功能耦合，導(dǎo)致許多細(xì)胞類型(包括唾液腺腺體細(xì)胞)內(nèi)的鈣動員。圖7顯示了這些受體在兩種細(xì)胞系中增強肌醇磷酸鹽生成的能力。這些數(shù)據(jù)與圖6顯示的結(jié)果一致，表明存在一個涉及IP的典型鈣離子級聯(lián)。

大鼠腮腺腺泡細(xì)胞中直接影響初級分泌液的產(chǎn)生和外泌的兩個主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是鈣信號途徑和環(huán)AMP信號途徑。盡管永生化細(xì)胞克隆對腎上腺素能再受體刺激的敏感性并不能很好地反映細(xì)胞的整體差異和功能，但環(huán)狀A(yù)MP途徑仍然是完全分化的唾液腺ac-inar細(xì)胞的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。為了更全面地描述這兩種細(xì)胞系中的環(huán)磷酸腺苷通路，并評估它們與各種細(xì)胞表面受體的聯(lián)系，研究人員進行了以下研究。圖8展示了一系列研究的結(jié)果，以評估腎上腺素能、血管活性腸肽和前列腺素E受體與腺苷酸環(huán)化酶的活化以及隨后細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀A(yù)MP的增加之間的耦合關(guān)系。-腎上腺素能受體刺激的反應(yīng)最大，其次是前列腺素E(PGE)受體的激活，而對血管活性腸肽(VIP)受體的研究結(jié)果不一。雖然相對較小，但兩種細(xì)胞系對VIP的反應(yīng)是一致的。

在單個細(xì)胞系的篩選和生長過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞克隆在培養(yǎng)過程中的生長速度明顯不同。圖9顯示了轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞系的生長速度。細(xì)胞系C10在轉(zhuǎn)染和再培養(yǎng)后經(jīng)過一段時間的延遲，其加倍時間約為22小時，而細(xì)胞系C5的加倍時間約為36小時。

圖3.C5的電子顯微照片

圖4.C5的電子顯微照片

圖5.C10的電子顯微照片

圖6.在C5和Cl細(xì)胞中裝入fura-2/AM，并測定[Ca2+]對指定濃度的UTP(開圓圈)、ATP(閉圓圈)和卡馬膽堿(開三角形)的反應(yīng)變化

圖7.促泌劑對腮腺尖銳濕疣細(xì)胞株中三磷酸肌醇總含量的影響

▲圖8.促泌劑對3'：5'-環(huán)單磷酸腺苷(環(huán)AMP)產(chǎn)生的影響

圖9.大鼠腮腺尖細(xì)胞系C5和C10的生長情況

研究結(jié)論：克隆腮腺腺泡細(xì)胞系(C5和C10)的表征

結(jié)論與討論

長期培養(yǎng)過程中建立了幾種大鼠腮腺細(xì)胞系。遺憾的是，進一步的研究表明，這些細(xì)胞系中的大多數(shù)要么來源于導(dǎo)管細(xì)胞，要么是分化不良的acinarcells。為了選擇和獲得永生化后能充分表達(dá)其表型潛能的細(xì)胞系，需要在了解細(xì)胞特異性培養(yǎng)條件。直到最近，人們才確定了在原代培養(yǎng)中維持分化良好的大鼠唾液腺尖腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件：(a)使用35%0，以最大限度地表達(dá)腮腺尖腺細(xì)胞生長和分化的表型;(b)在培養(yǎng)基中加入地塞米松EGF和視黃酸;(c)將層粘蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。所有這些都是為了在轉(zhuǎn)染后最大限度地獲得分化良好的細(xì)胞系。在開發(fā)細(xì)胞系之前，已建立了最佳的細(xì)胞生長條件和最佳的轉(zhuǎn)染條件。大鼠唾液腺刺痛細(xì)胞在塑料上生長不良，也不能在培養(yǎng)物中繼續(xù)繁殖，因此研究人員采用了選擇篩選程序，而不是使用抗生素篩選。相反，在短時間后，它們會開始分化并死亡(Quissell等人，1994年)。這一事實使研究人員能夠在轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞保存在細(xì)胞外基質(zhì)(絲裂霉素C處理過的3T3成纖維細(xì)胞)上數(shù)個傳代，使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在塑料上生長之前有更多的時間適應(yīng)。免疫熒光抗體探針的使用和呋喃-2/AM程序?qū)κ荏w耦合細(xì)胞內(nèi)鈣動員的評估，結(jié)合光鏡和電子顯微鏡的評估和分析，極大地促進了篩選過程。

利用pSVori-質(zhì)粒是建立永生化大鼠腮腺尖突細(xì)胞的有效方法。研究人員獲得了大量永生化細(xì)胞系。然而，研究人員的任務(wù)是能夠快速識別和篩選出少數(shù)高度分化的細(xì)胞系。建立選擇標(biāo)準(zhǔn)，利用細(xì)胞功能的多個要素對每個細(xì)胞系進行評估，極大地促進了選擇過程。

雖然這些研究的目的不是為了了解細(xì)胞的永生化過程，但大T抗原的持續(xù)表達(dá)將這些細(xì)胞歸入了Gluzman等人(1980年)定義的突變體的第一類或分類：即永生化細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)可檢測到的大T抗原水平。腮腺細(xì)胞系C5和Cl0現(xiàn)已經(jīng)歷了30多次傳代，但仍保持著中高水平的腮腺分化和功能。P物質(zhì)受體介導(dǎo)的鈣動員反應(yīng)消失，而Pzu-嘌呤受體反應(yīng)在初次培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染后顯著增強，其原因尚不清楚。雖然期望永生化細(xì)胞系完全維持母細(xì)胞的正常體內(nèi)表型是不現(xiàn)實的，但目前還不清楚這兩個事件是相互關(guān)聯(lián)還是巧合。要想更全面地了解這些觀察結(jié)果，還需要做進一步的研究。此外，兩個細(xì)胞系似乎都不表達(dá)a-淀粉酶，因為沒有通過免疫熒光檢測到。但是，缺乏a-淀粉酶表達(dá)并不完全是抑制作用，因為細(xì)胞在霍亂毒素存在的情況下(轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染期間)受到了生長刺激。細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀A(yù)MP水平的升高會降低a-淀粉酶的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能和腎上腺素能受體介導(dǎo)的反應(yīng)的維持與克隆細(xì)胞系的細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，而腎上腺素能偶聯(lián)環(huán)AMP反應(yīng)則存在于所有測試的上皮細(xì)胞克隆中，與分化程度無關(guān)。需要進一步研究來確定環(huán)AMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否是細(xì)胞永生化的必要條件，或者研究人員的觀察結(jié)果是否只是巧合。β-腎上腺素能原位刺激會導(dǎo)致唾液腺尖突細(xì)胞生長急劇增加。

形態(tài)學(xué)評估表明，這兩種細(xì)胞系具有中高程度的細(xì)胞分化。在研究人員的鈣動員研究中，許多對膽堿能和/或腎上腺素能受體激動劑無反應(yīng)的低分化細(xì)胞克隆的細(xì)胞分化程度也很低。通常情況下，在這些低分化細(xì)胞中，缺乏正常分泌功能所必需的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、分泌顆粒和事件連接。

C5和C10細(xì)胞系都顯示存在發(fā)育完全的連接復(fù)合體和末端網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這很重要，因為這些形態(tài)結(jié)構(gòu)對有效分泌很重要。當(dāng)這兩種細(xì)胞系在涂有膠原蛋白的可滲透支撐物上生長時，發(fā)現(xiàn)跨細(xì)胞再阻力增加。用Evomvoltohmmeter測量，C5單層細(xì)胞的跨細(xì)胞電阻為724+91歐姆/平方厘米(n=6)，而C0細(xì)胞的跨細(xì)胞電阻值為75252歐姆/平方厘米(n=7)。這些數(shù)值與其他成功用于烏星室研究的上皮細(xì)胞系相比毫不遜色。研究人員還不知道其他唾液腺細(xì)胞系成功用于烏星室研究的報道。初步數(shù)據(jù)表明，ClO形成緊密的極化單層，鹽離子在單層上定向移動，這種離子移動受核苷酸和毒蕈堿受體激動劑的調(diào)節(jié)。

另一方面，分泌物和其他唾液物質(zhì)分泌所需的結(jié)構(gòu)分布不均。有相當(dāng)數(shù)量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但其中大部分似乎并不活躍。高爾基體稀少，存在分泌顆粒，但數(shù)量不多，只有少數(shù)位于外泌中間。細(xì)胞大小和雙相亞結(jié)構(gòu)與成熟的大鼠腮腺腺細(xì)胞一致、因此，這兩種細(xì)胞系都可以被描述為由中度到高度分化的腮腺尖狀腺細(xì)胞組成，其中C5細(xì)胞系的分化功能最強。

要更全面地評估這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞和分泌功能水平，還需要進一步的研究。不過，安博士實驗室最近的研究(Lin等人，1996年)表明，細(xì)胞系C5保留了組織特異性富脯氨酸蛋白R15表達(dá)所必需的近端和遠(yuǎn)端調(diào)控元件的基本調(diào)控蛋白。該細(xì)胞系使這些研究人員得以確定協(xié)調(diào)控制大鼠腮腺針葉富脯氨酸蛋白的組織特異性和誘導(dǎo)性基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過一年的培養(yǎng)，這兩種細(xì)胞系維持了相當(dāng)高的細(xì)胞分化和功能水平，因此，它們很有希望為體外研究大鼠腮腺吖丙腺細(xì)胞的分子和細(xì)胞生物學(xué)提供合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。