MDCK細(xì)胞準(zhǔn)備工作

準(zhǔn)備工作對開展MDCK細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，準(zhǔn)備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。

ATCC細(xì)胞庫MDCK細(xì)胞圖片

逸漠細(xì)胞庫MDCK細(xì)胞圖片

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)實驗準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面。

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器、吸管、多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

試劑：MEM培養(yǎng)液、緩沖液、PBS、消化液、血清、抗生素。

MDCK細(xì)胞背景簡介

MDCK細(xì)胞系(MDCK CELL LINES)是S.H.MADIN于1958年9月建成，來源于考克斯班尼犬腎臟，該腎臟細(xì)胞原代培養(yǎng)時其形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，經(jīng)過胰蛋白酶和EDTA混合消化液的連續(xù)6次消化法純化而上皮樣細(xì)胞，每次純化間隔時間為7D。培養(yǎng)中MDCK細(xì)胞具有遠(yuǎn)段腎小管與集合管，來源細(xì)胞的分化特性。MDCK細(xì)胞株至少有兩種細(xì)胞類型，一種命名為C5A，其在含I型膠原的培養(yǎng)物中生長時，能分泌液體，導(dǎo)致囊腫形成，但在塑料面的培養(yǎng)低物上培養(yǎng)時，能分泌液體，卻不能形成囊腫，另一種細(xì)胞正好相反。

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基：MEM(ATCC改良)+10%FBS+PS

生長條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

傳代方法：1:2至1:3，每周 2-3次

凍存條件：無血清凍存液(或者冷凍保存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配)，液氮儲存

消化時間：1-3min(視細(xì)胞情況而定)

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

1.運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，請按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。

2.MDCK細(xì)胞首次傳代建議1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿，不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)操作

MDCK細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.將含有1 mL MDCK犬腎細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻;

2.在1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻;

3.將所有MDCK犬腎細(xì)胞胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中，加入約4 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜);

4.第二天換液并檢查MDCK細(xì)胞密度。

MDCK細(xì)胞傳代步驟

如果MDCK細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗MDCK細(xì)胞1-2次。

2.加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有MDCK細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min(視細(xì)胞情況而定)，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加2-3ml完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

3.將MDCK細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

MDCK細(xì)胞凍存方法

待MDCK細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例;

1.收集MDCK細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。

2.根據(jù)MDCK細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

3.將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

MDCK細(xì)胞應(yīng)用

MDCK細(xì)胞被廣泛用作遠(yuǎn)曲小管或集合管的模型，還可用于代謝研究和Pg級藥物與藥物相互作用研究以及觀察流感病毒株對細(xì)胞功能的影響。

MDCK細(xì)胞系(MDCK?Cell?Lines)廣泛用于多種病毒的擴增和純化，如：(呼腸孤病毒、腺病毒、?犬細(xì)小病毒、貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒)及禽流感病毒等。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，MDCK細(xì)胞系被公認(rèn)為最適于甲、乙型流感病毒疫苗生產(chǎn)的3種細(xì)胞系之一。

傳統(tǒng)的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)大多采用有血清貼壁培養(yǎng)方式。血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種復(fù)雜混合物，其含有細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，可以有效地促進細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)。

用于基于MDCK細(xì)胞高密度培養(yǎng)的甲型流感病毒疫苗生產(chǎn)工藝開發(fā)與優(yōu)化研究;

通過考察微載體和血清對細(xì)胞生長的影響以及感染參數(shù)對病毒生產(chǎn)效率的影響,確定了基于MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗生產(chǎn)的基本工藝。

研究表明，Cytodex-1和Cytodex-3兩種微載體均能支持MDCK細(xì)胞正常貼附生長,胎牛血清(FBS)支持細(xì)胞生長的作用顯著優(yōu)于新生小牛血清(NBS)。以2 g/L濃度的Cytodex-1或3 g/L的Cytodex-3為貼附基質(zhì)，以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加7.5%(v/v)的FBS便能確保MDCK細(xì)胞正常生長，細(xì)胞密度可達(dá)5.50×106 cells/ml;事關(guān)流感病毒感染復(fù)制的三個關(guān)鍵參數(shù)TPCK-胰酶濃度、MOI和TOI均對病毒增殖具有顯著影響，采用5.0 mg/L的TPCK-胰酶濃度、0.01的MOI和72 h的TOI較為適宜;據(jù)此建立了基于MDCK細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)的流感病毒基本生產(chǎn)工藝，流感病毒HA滴度值達(dá)到210.13±0.18 HA units/50μl，單位細(xì)胞病毒產(chǎn)率Svy為(6.09±0.44)×103virions/cell。

上述生產(chǎn)工藝雖可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的基本需求，但其生產(chǎn)效率仍有較大提升空間。為了進一步提高生產(chǎn)效率，本文繼而通過考察維持培養(yǎng)基的關(guān)鍵組分對產(chǎn)毒期MDCK細(xì)胞密度維持、代謝和病毒增殖的影響，分析了病毒增殖過程對營養(yǎng)代謝的需求，進一步優(yōu)化了維持培養(yǎng)基。

研究表明產(chǎn)毒期的換液操作可顯著提高單位細(xì)胞的病毒產(chǎn)率，由此可知在細(xì)胞產(chǎn)毒階段改善培養(yǎng)環(huán)境的營養(yǎng)供給對病毒高效增殖尤為重要。