今天推薦的是由首爾國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院在1995年發(fā)表于International Journal of Cancer的一篇文章(Q1,7.314)，通訊作者是Jae-Gahb Parki。

摘要部分

研究人員鑒定了8株從韓國人原發(fā)性腫瘤中建立的人肝癌細胞系。 大多數(shù)培養(yǎng)的細胞保持了它們所衍生的原始腫瘤的許多形態(tài)學(xué)特征。 倍增時間為34～72小時。 所有品系均表現(xiàn)出較高的生活力，且未被支原體或細菌污染。 所有品系均為非整倍體，經(jīng)DNA圖譜分析證實為單倍體。 乙型肝炎病毒(HBV)DNA整合在所有品系的基因組中。 其中兩株細胞系(SNU-354、SNU-368)表達HBV和HBVX(HBX)轉(zhuǎn)錄物。 Snu-354強表達白蛋白，Snu-368表達轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素樣生長因子II。 沒有一個品系在RNA和蛋白質(zhì)水平上產(chǎn)生甲胎蛋白。 這些細胞系為肝癌相關(guān)的體外研究提供了有用的工具。本文報道了8個新建立的肝癌細胞LINCs(SNU-182、354、368、387、398、423、449和475)的特性。 測定細胞系表型，包括形態(tài)學(xué)和體外生長特性。 研究人員對HBV病毒轉(zhuǎn)錄本、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)進行了分子鑒定，包括DNA指紋圖譜分析和RNA表達。 同時檢測胰島素樣生長因子I1(IGF-11)的RNA表達。

研究背景

肺肝細胞癌(HCC)是世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，每年約有100萬人因此死亡。 盡管有流行病學(xué)和實驗證據(jù)表明黃曲霉毒素等多種化學(xué)致癌物與HCC有關(guān)，但持續(xù)性乙型肝炎病毒(HBV)感染一直被認(rèn)為是HCC的主要病因，占全球HCC的80%(Biscegli et al.1988)。 通過將克隆的病毒DNA轉(zhuǎn)染到永生化細胞系或使用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠來研究HBV在肝癌發(fā)生中的作用。 另一種方法是使用整合HBV DNA的肝癌細胞系。 雖然從肝癌衍生的永久性細胞系將擴大肝癌發(fā)生研究的范圍，但只有少數(shù)細胞系可用于研究。 此外，由于碘油和化療藥物的介入治療，肝癌細胞系的建立越來越少。 術(shù)前應(yīng)用這些治療方法會導(dǎo)致腫瘤組織廣泛壞死，在手術(shù)時只留下少量可共培養(yǎng)的存活腫瘤細胞。

研究材料方法

1. 細胞培養(yǎng)

細胞系是從病理證實的肝癌中建立的。 實體瘤用剪刀細小切碎，移液分離成小團聚體。 取適量的細小腫瘤組織碎片接種于25cmz燒瓶中。 腫瘤細胞在添加5%熱滅活胎牛血清(AR5)的ACL-4培養(yǎng)基中初步培養(yǎng)。 ACL-4是一種完全定義的培養(yǎng)基，用于人肺腺癌的選擇性生長，并已證明可用于建立結(jié)直腸細胞系。 ACL-4的組成包括RPMI 1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胰島素(20 pg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10 pGIml)、亞硒酸鈉(25 nm)、氫化可的松(50 nm)、表皮生長因子(1 ng/ml)、乙醇胺(10 pm)、磷酰乙醇胺(10 pm)、三碘甲狀腺原氨酸(100 pm)、牛血清白蛋白(2 mg/ml)、Hepes緩沖液(10 mm)、谷氨酰胺(2 mm)和丙酮酸鈉(0.5 mm)。 RPMI1640、谷氨酰胺和丙酮酸鈉從GIBCO/BRL)中得到; 表皮生長因子來自(Waltham，MA); 所有其他試劑均從西格瑪獲得。 建立后，在添加10%熱滅活胎牛血清(RIO)的RPMI1640中培養(yǎng)。 當(dāng)觀察到大量腫瘤細胞生長時，進行初始細胞傳代。 隨后每1~2周傳代一次，貼壁培養(yǎng)在胰蛋白酶化后的亞匯合處傳代。 如果在初始培養(yǎng)中注意到基質(zhì)細胞生長，則使用胰蛋白酶獲得純腫瘤細胞群。 培養(yǎng)物在37°C的加濕培養(yǎng)箱中，在5%C02和95%空氣的條件中培養(yǎng)。 從ATCC(Rockville,MD)獲得HCC細胞系Hep3b和SK-Hep-1，以及肝母細胞瘤細胞系HepG2作為對照。

2.細胞系生長特性

通過將0.5～3×LO5活細胞接種到25cm2的燒瓶中，每天計數(shù)14天或更多天來確定群體生長時間。 培養(yǎng)物在計數(shù)前每3或4天和24小時換液一次。 用0.4%臺盼藍染色的染料排除法測定細胞活力方法并用血細胞計數(shù)儀計數(shù)活細胞。

為了對細胞系進行形態(tài)學(xué)研究，每天對生長在75cm2培養(yǎng)瓶上的細胞進行相差顯微鏡觀察。 在Flaskette室載玻片(NUNC，Naperville，IL)上培養(yǎng)的細胞，用PBS洗滌，4%多聚甲醛和0.1M碳酸鈣鈉固定30min，蘇木精和伊紅染色。 以0.1kg/ml終濃度處理45 min后，用標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)干法從指數(shù)生長培養(yǎng)物中制備染色體玻片。 用快速G-顯帶法染色，并從SO中期擴散評估模式染色體數(shù)。 支原體污染用直接瓊脂分離和微生物聯(lián)合公司(Bethesda，MD)的Hoechst染色法檢測。 所有品系都進行了細菌污染測試。 用Authentikit系統(tǒng)(康寧、東沃波爾、馬薩諸塞州)對細胞勻漿進行淀粉凝膠電泳檢測：乳酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、嘌呤核苷磷酸化酶和蘋果酸脫氫酶。

表1-肝癌細胞系的來源

3.甲胎蛋白(AFP)與乙型肝炎病毒測定

由放射免疫法測定細胞裂解液和培養(yǎng)上清中AFP和HBsAg蛋白水平。 將細胞(1×LO6)接種到2個75cm2的燒瓶中，半?yún)R合時洗滌3次。 兩天后，一個燒瓶中的細胞胰蛋白酶化后計算，然后丟棄。 從另一個燒瓶中收集細胞，洗滌3次，再次懸浮在1%非ID-P-40和100 p，m苯基甲基磺酰氟(約5～10 ng蛋白質(zhì)/ml)中，在冰上超聲兩次15秒，在-70℃下保存直到檢測。 從同一燒瓶中收集上清液，澄清，并冷凍保存，直到化驗。 AFP用單克隆試劑盒(Dainabot,Tokyo,Japan)測定，HBSAG用另一個單克隆試劑盒(Abbott,North Chicago,IL)測定。

4. DNA和RNA提取

通過硫氰酸胍勻漿，然后在氯化銫墊上超速離心，從洗滌的細胞顆粒中獲得總RNA和DNA。 隨后，通過蛋白酶-K酶切和苯酚總管萃取法制備總基因組DNA(Sambrook et al.1989)。

5. 雜交探針

為了進行DNA圖譜分析，使用3種多態(tài)性DNA探針，即2號染色體上的PYNH24(ATCC)、12號染色體上的CHDTC-15和20號染色體上的CHDTC-114來檢測可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTRs)。 檢測HBX和PreS/S轉(zhuǎn)錄本的HBV DNA是從韓國HBV感染者中分離的ADR亞型。 以pBR322的BamHI位點克隆2個拷貝的HBV DNA,從pHBV315二聚體質(zhì)粒制備完整的X基因。 用pHBV315的nCOI/Alui片段作為X的探針，將pHBV315的一個部分消化的Hincii片段克隆到pUC19的Hincii位點。 用BSTXI/PSTI消化529bp的HBV DNA片段克隆到pUC19中，進行PRES/S探針。 用探針PAM6(ADW亞型，ATCC)檢測病毒DNA整合和HBV基因表達。 如所述，IGF-I1探針的TaqI/Clai片段從pyrm-114載體中分離。 P-肌動蛋白序列編碼的cDNA克隆(來自J.Battey，NCI，Bethesda，MD)用于比較RNA載量。 用隨機引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,In)用[W~P]~CTP(3000ci/mmol)標(biāo)記探針。

6.Southern雜交技術(shù)在HBVDNA圖譜及鑒定中的應(yīng)用

用70個單位的HINFF限制性內(nèi)切酶消化10微克DNA樣品，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham,Arlington Heights,IL)。 在6×SSC，0.1%SDS，5×Denhardt溶液中，在沙門氏菌DNA存在下，于65℃預(yù)雜交膜。 與高度多態(tài)性探針PYNH24、CHDTC-15和CHDTC-114進行雜交(Honma et al.1991)。 雜交后，在室溫下2×SSC/O.L%SDS中洗滌兩次20 min,在60℃下1×SSC/0.1%SDS中洗滌兩次10 min。 雜交后的膜在-70℃下暴露于柯達XARJ膠片(伊士曼柯達，羅切斯特，紐約州)1-3天。 在另一個實驗中，用HAEIII限制性內(nèi)切酶消化DNA，并如上所述與PYNH24雜交。 為鑒定HBV DNA整合，每個DNA樣品10 pg用10單位EcoRI或Hindiii分別經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。 以C-~-~P標(biāo)記的3.2kb全長HBV DNA克隆(PAM6)為探針。 雜交和放射自顯影按上述方法進行。

7.HBC、IGF-II及肝相關(guān)基因的表達 動脈血氣測量

小每株細胞的總RNA(20 pg)在1%瓊脂糖GE1/6%甲醛上電泳，在10×SSC中浸泡兩次20分鐘，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上。 用比活性為3×LO8cpm/ml的隨機引物標(biāo)記的探針(HBV、HBX、PRES/S和IGF-11)在42℃下雜交16小時，然后在室溫和42℃下用2×SSC/O.1%SDS洗滌。 放射自顯影是在-70℃下進行的。 為了確定AFP、白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)基因的THC表達，用ABI 381A DNA合成器(Application Biosystems,Forster City,CA)合成AFP(Morigana et al.1983)、白蛋白(Lawn et al.1981)和TF(Yang el al.1984)特異地合成寡核苷酸序列，用Bio-Spin 6柱(Bio-Rad,Richmond,CA)純化，用T4多核苷酸激酶(Gibco/BRL)磷酸化[Y-32P]DATP標(biāo)記S端。 雜交和放射自顯影按上述方法進行。

研究結(jié)論

1.細胞系特征

在AR5培養(yǎng)基中建立了8株肝癌細胞系，均來源于韓國人的原發(fā)腫瘤。4例患者曾接受過碘油加阿霉素單獨或阿霉素與絲裂霉素-C聯(lián)合應(yīng)用的經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞(TAE)治療(表一)。 群體倍增時間為34～72小時，細胞活力為74～99%。 所有品系都表達了4種酶的人類形式，所有品系都不受細菌或支原體的污染。 形態(tài)學(xué)研究為了進行形態(tài)學(xué)分析，研究人員根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)和其他分類系統(tǒng)對原始腫瘤的大體和組織學(xué)特征進行分類。 原發(fā)腫瘤多為單發(fā)結(jié)節(jié)(SNU182、SNU-354、SNU-368和SNU-387)、單發(fā)結(jié)節(jié)伴結(jié)節(jié)周圍擴展(SNU-398、SNU-423和SNU-449)或塊狀生長型(SNU-475)。 組織學(xué)上，原發(fā)腫瘤包括以致密小梁型為主(SNU-387，SNU-449和SNU-475)(圖L),小梁型(SNU-354，SNU-398和SNU-423)(圖),或以小梁和小腺泡型為主(SNU-182和SNU-368)。 多數(shù)腫瘤分化較差，但單個細胞形態(tài)與正常肝細胞相似，符合圖1型肝硬化組。 SNU-398和SNU-423的原發(fā)腫瘤均為多形細胞型。 SNU-398由小型間變性細胞組成和多核腫瘤巨細胞的SNU-423。 這2個腫瘤的形態(tài)如圖2所示。 在幾種細胞系(SNU-368、SNU-398和SNU-423)的原發(fā)腫瘤中，細胞漿內(nèi)透明球較常見。 培養(yǎng)中，除SNU-398外，其余細胞均為貼壁細胞。 SNU-398系來源于多形性Ⅳ級癌，生長為漂浮細胞和貼壁細胞。 腫瘤細胞多呈多角形，胞質(zhì)豐富，細胞核大、圓、泡狀，有多個核仁。 部分細胞系(SNU-398、SNU-423和SNU-475)為多核腫瘤細胞。 一些細胞維持胞漿內(nèi)透明球(SNU-368、SNU-398和SNU-423)的產(chǎn)生，如原始腫瘤(圖2)所示。 SNU-387細胞株在原發(fā)腫瘤和細胞株中均表現(xiàn)出明顯的核卷積。 三個細胞系(SNU-387、SNU-449和SNU-475)來源于原始腫瘤，表現(xiàn)出主要的致密生長模式，生長為彌散擴散的單層細胞。 其余細胞系(SNU-182、SNU-354、SNU-368、SNU-398和SNU-423)均來源于原發(fā)腫瘤小梁排列。 這些細胞系呈擴散聚集型生長。 原始腫瘤和培養(yǎng)腫瘤的形態(tài)學(xué)特征的比較總結(jié)在表III中。

表3-肝癌細胞系的WTRO和體內(nèi)特性

圖1-擬肝硬化型肝細胞癌的形態(tài)學(xué)。 (A)SNU-368原發(fā)腫瘤表現(xiàn)為小梁和腺泡組織學(xué)(H+E染色)。 (b)SNU-368相差顯微鏡顯示均勻多邊形貼壁細胞。 (c)SNU-475原發(fā)腫瘤呈致密小梁組織學(xué)(H+E染色)。 (d)培養(yǎng)的SNU-475細胞由可變大小的多邊形細胞組成。 刻度尺50um。

圖2-多形型肝細胞癌的形態(tài)學(xué)。 (A)SNU-398原發(fā)腫瘤由間變性小細胞組成(H+E染色)。 (B)培養(yǎng)的SNU-398細胞由混合的黏附細胞和漂浮細胞組成。 (c)SNU-423原發(fā)腫瘤為小梁型多核巨細胞(H+E染色)。 (D)培養(yǎng)的SNU-423細胞可見多核多角形細胞和小梭形細胞。 刻度桿，50um。

2.AFP和HBsAg

在培養(yǎng)的細胞裂解液和上清液中，AFP和HBsAg蛋白水平均低于可檢測水平。

3.細胞遺傳學(xué)研究

細胞遺傳學(xué)研究表明，所有的細胞系都是非整倍體，模式染色體數(shù)目從57到85不等(表2)。

4.DNA Profies與HBVDNA整合

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶HINFL和多態(tài)性DNA探針PYNH24、CHDTC-15和CHDTC114對8株SNU HCC細胞株進行了DNA圖譜分析，結(jié)果表明8株SNU HCC細胞株是不同的細胞株(圖3)。 與已存在的3種HCC細胞株SK-Hep-1、Hep3b和HepG2相比，它們也顯示出不同的DNA圖譜。 CHDTC-114的等位基因帶數(shù)大于14條(1.9～5.1kb),CHDTC-15的等位基因帶數(shù)大于19條(4.6～23.1kb)。 用限制性內(nèi)切酶HAEII和多態(tài)性DNA探針PYNH24對8株SNU HCC細胞株進行DNA圖譜分析，結(jié)果顯示8株SNU HCC細胞株有10條以上的等位基因帶，大小為1.1～2.7kb。 這些結(jié)果可以排除細胞系之間交叉污染的任何可能性。 用Southern印跡雜交法(圖4)在Ecori和Hindiii消化的細胞DNA中均檢測到2 3KB2 OKB乙型肝炎病毒DNA。 相對較高分子量的酶切帶提示HBV DNA的整合形式。 每個細胞系顯示不同的HBV整合模式。

圖3--HINFL Southern雜交HCC細胞株的DNA圖譜，與CHDTC-15和CHDTC-114雜交。 這8株SNU HCC細胞系是獨一無二的，且無親緣關(guān)系。圖4-Hindiii消化的HCC細胞株DNA中RGURE 4整合的HBV DNA序列。

5.RNA表達

Hep3b(3.2kb)和Snu-368(3.2kb)檢測HBV基因組RNA。 Snu-354也顯示HBV基因組RNA弱表達，但轉(zhuǎn)錄本的大小較小，只有2.3kb。 HBx轉(zhuǎn)錄本在Hep3b,Snu-354(2.3kb)和Snu-368(3.2kb)(圖5)中表達。 PreS/S RNA在所有細胞系中均未表達。 IGF-I1 RNA在Hep 3b、Hep G2和Snu-368(圖5)中均有表達。無一例細胞在RNA水平上產(chǎn)生AFP，證實了放射免疫分析的結(jié)果。 白蛋白RNA僅在SNU-354中檢測到，TF RNA僅在SNU-368(圖6)中檢測到。 SNU-449中白蛋白的表達及SNU-449和SNU-475中TF的表達均在檢測范圍內(nèi)。 在Hep 3b和Hep G2細胞系中檢測到AFP、白蛋白和TF的RNA，這與以前的結(jié)果一致(Miyazaki and Narnba，1994)。

圖5-SNU肝癌細胞系HBV轉(zhuǎn)錄本和IGF-I1的RNA表達模式。 圖6-使用32P標(biāo)記的白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白特異性合成寡核苷酸探針對肝癌細胞株進行Northern-blot分析。

討論

HBV基因整合在慢性感染和肝癌中的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了基于HBV整合在肝癌發(fā)展中的研究。 HBV基因整合的HCCs永久細胞系應(yīng)為闡明HBV相關(guān)的人肝癌發(fā)生機制提供良好的基礎(chǔ)，因為純細胞培養(yǎng)可用于各種無法在組織標(biāo)本上進行的研究。 然而，自1985年以來，關(guān)于建立肝癌細胞系的報道明顯減少，最近將肝癌細胞培養(yǎng)為永久系的嘗試有些令人失望。 據(jù)研究人員所知，目前大約有40種人肝細胞腫瘤細胞系，包括文獻中提到的HCCS和肝母細胞瘤。 此外，在宿主基因組中整合HBV基因的HCC細胞株數(shù)量有限。 新建立的HBV基因整合的HCC細胞系有望拓寬HBV相關(guān)HCCS的研究范圍。本文報道了8株新建立的HBV基因整合的肝癌細胞株。 結(jié)果表明，AR5培養(yǎng)基在人肝細胞選擇性生長中的成功率為29%(28個試驗中有8個)，反映了AR5培養(yǎng)基在人肝細胞選擇性生長中的相對效率諾瑪。 8株肝癌細胞的群體倍增時間為34～72h，細胞活力為74～99%。 所有品系均為非整倍體，模式染色體數(shù)目在57～85之間。 用多態(tài)性DNA探針PYNH24、CHDTC-15和CHDTC114進行DNA指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)這8株HCC細胞株與SK-Hep-1、Hep3b和HepG2細胞株是唯一的、無親緣關(guān)系的。 從肝癌建立的細胞系的形態(tài)學(xué)特征尚未得到充分詳細的討論。

 在研究人員的細胞系中，研究人員觀察到兩種類型的生長特征，包括擴散生長和擴散聚集生長模式。 這些細胞系的生長模式似乎與原發(fā)腫瘤的生長模式有關(guān)。 表現(xiàn)為彌散生長的細胞系來源于以致密生長為主的腫瘤，而表現(xiàn)為擴散和聚集生長的細胞系來源于小梁和/或假腺體生長的腫瘤。 此外，大多數(shù)培養(yǎng)的細胞保持了原腫瘤的形態(tài)特征，包括胞漿內(nèi)透明球、染色質(zhì)模式和核形狀。 研究人員認(rèn)為，盡管細胞系在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生了形態(tài)和功能上的改變，但由于其環(huán)境適應(yīng)，它們?nèi)匀槐３至怂鼈兯苌脑寄[瘤的大部分形態(tài)特征。 已知HBV(HBX)的X基因在肝癌發(fā)展中起著重要作用，因為它具有跨激活基因表達的能力。

最近關(guān)于PreS/S序列截斷形式的數(shù)據(jù)顯示，在許多不同的啟動子上有轉(zhuǎn)錄的跨激活子功能，提示HBV存在一個額外的病毒跨激活子在肝癌形成過程中發(fā)揮作用。 為了了解整合的HBV基因在研究人員的細胞系中是否有轉(zhuǎn)錄活性，研究人員檢測了HBV病毒的表達模式轉(zhuǎn)錄本，使用總HBV、HBX和PRES/S基因的cDNA探針。 HBV基因組RNA在SNU-368和Hep3b細胞系中表達。 已知細胞系Hep3b有1至2個HBV DNA拷貝整合到宿主基因組中，并表達各種大小的HBV病毒轉(zhuǎn)錄物。 Snu-354也表達HBV基因組RNA，但表達量小于Snu-368和Hep3b。 這可能反映了HBV基因的一種截斷形式。 HBX基因轉(zhuǎn)錄本僅在Snu-354和Snu-368中表達。 在自然感染的肝細胞中，主要的病毒RNA轉(zhuǎn)錄本大小分別為2.3kb和3.5kb，分別來自S啟動子和C啟動子這兩個啟動子產(chǎn)生X蛋白。 在SNU-354和SNU-368中的發(fā)現(xiàn)與這些值非常接近，盡管還沒有對整合的HBV基因進行準(zhǔn)確的分析。 PreS/S基因轉(zhuǎn)錄本在所有細胞系中均未表達。 對原發(fā)性人HCCs的研究表明，在大多數(shù)病例中，IGF-I1 RNA表達的胎肝模式。 本研究在Hep 3b、Hep G2和SNU-368中表達了一個5.6kb的IGF-I1轉(zhuǎn)錄本。 

研究人員在此描述了8個新建立的HCC細胞系的特征，所有細胞系的基因組中都整合了HBV DNA，但只有2個細胞系表達HBV和HBX轉(zhuǎn)錄本，而沒有一個細胞系表達PreS/S基因轉(zhuǎn)錄本。 為了解釋這些發(fā)現(xiàn)與肝癌病因的關(guān)系，研究人員目前正在研究p53基因突變與整合HBV DNA轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系。 新特征的HCC細胞株應(yīng)為研究人肝細胞癌提供良好的體外模型。