RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞取材于Abelson小鼠白血病病毒誘發(fā)的腫瘤組織，是科研上常用的炎癥細(xì)胞模型之一。RAW 264.7細(xì)胞系是合適的轉(zhuǎn)染宿主。細(xì)胞將胞飲中性紅并吞噬乳膠珠和酵母聚糖。它們能夠依賴抗體對綿羊紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)進(jìn)行裂解。LPS 或 PPD 治療2天會刺激紅細(xì)胞裂解，但不會刺激腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)。

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)和常見問題

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品

培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+PS、培養(yǎng)皿、無血清凍存液等

培養(yǎng)條件氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

RAW 264.7細(xì)胞復(fù)蘇操作

a、將含有1mLRAW 264.7細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。

b、在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。

c、然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜)。第三天換液并檢查細(xì)胞密度。

RAW 264.7細(xì)胞傳代處理

傳代密度：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)

傳代：1:2至1:3 每周3次

RAW 264.7細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)步驟

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1次。

b、加2 mL預(yù)冷的PBS溶液于培養(yǎng)瓶中，使PBS溶液浸潤所有RAW 264.7細(xì)胞，然后輕輕吹下細(xì)胞，將吹下來的細(xì)胞及細(xì)胞懸液收集到無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

c、將RAW 264.7細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RAW 264.7細(xì)胞凍存處理

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為例

RAW 264.7細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)步驟

a、收集RAW 264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)RAW 264.7細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1.運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。

2.收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代，1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

3.由于RAW264.7細(xì)胞易有不同形態(tài)，傳代時(shí)就會發(fā)現(xiàn)形態(tài)變?yōu)樗笮蔚募?xì)胞很難消化下來，輕敲培養(yǎng)皿細(xì)胞不會脫落，用力吹打又容易對細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷，因此要盡量避免細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。即在接種細(xì)胞時(shí)保持一個(gè)適中的傳代密度，避免其向終末細(xì)胞分化，因?yàn)橐坏┘?xì)胞發(fā)生分化變?yōu)殚L形是無法恢復(fù)的，這是培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)最需要注意的問題。

4.RAW264.7細(xì)胞喜歡連片生長，正常狀態(tài)下應(yīng)該是一小片一小片的分布在培養(yǎng)皿中，片片之間不相連接，等到長到更多更密的時(shí)才會連成大片，但同時(shí)也會疊加成層，容易出現(xiàn)部分細(xì)胞飄起無法貼壁的問題。所以，要關(guān)注好細(xì)胞的匯合程度，控制好細(xì)胞的生長速度，不能等到疊加成層時(shí)才去傳代。

5.RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁時(shí)間較短，半小時(shí)左右絕大部分細(xì)胞就能夠貼下去，剛貼壁時(shí)細(xì)胞呈圓形，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個(gè)個(gè)地散落于培養(yǎng)皿中。生長一段時(shí)間后，部分細(xì)胞會變成類似四角形，伸出偽足之類的。這個(gè)時(shí)候就是在提醒你注意傳代了，此時(shí)無論匯合度如何都需要進(jìn)行傳代了，因?yàn)樾螒B(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)結(jié)果會產(chǎn)生較大影響，最終造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不理想。

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)常見問題

在培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的過程中容易遇到的問題主要包括以下幾種：

1. 復(fù)蘇后存活率不高

2. 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異

3. 不同形態(tài)細(xì)胞消化時(shí)間不等

4. 細(xì)胞生長速度緩慢

當(dāng)你遇到類似問題時(shí)，可嘗試以下幾種解決方案。

1. RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后存活率不高

原因： RAW264.7細(xì)胞不同生長密度下細(xì)胞形態(tài)不同，若復(fù)蘇密度太高，細(xì)胞增殖過快，會加劇細(xì)胞的營養(yǎng)缺失，加速細(xì)胞老化;若復(fù)蘇密度太低，細(xì)胞生長緩慢。

解決辦法： 直徑10cm的培養(yǎng)皿復(fù)蘇細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量控制在1.0×106~1.5×106個(gè)

2. RAW264.7細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異

原因： RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會促使該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長梭形，形態(tài)發(fā)生變化。

解決辦法： 改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，例如與細(xì)胞接觸的器皿保證無菌，使用質(zhì)量較高的胎牛血清。

3. RAW264.7細(xì)胞不同形態(tài)細(xì)胞消化時(shí)間不等

原因： 細(xì)胞老化后，形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞偽足變得多且長，這使得這種形態(tài)的細(xì)胞變得較難消化，使用胰酶長時(shí)間消化又會對細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷。

解決辦法： 可在正常時(shí)間終止消化，收集大部分正常狀態(tài)的細(xì)胞，再加入新的胰酶繼續(xù)消化，而偽足過多過長的細(xì)胞，即使加胰酶消化10min及以上也是難以消化下來的，勉強(qiáng)消化下來，對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也會產(chǎn)生較大影響，即沒必要每次傳代都收集全部細(xì)胞，已經(jīng)發(fā)生分化的細(xì)胞無需保留要及時(shí)丟棄。

4. RAW264.7細(xì)胞生長速度緩慢

原因： 傳代時(shí)匯合度過低會導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，甚至難以貼壁，或是細(xì)胞發(fā)生了支原體污染。

解決辦法： 定期傳代，控制好傳代比例，匯合度不可過低。及時(shí)進(jìn)行支原體檢測，如發(fā)現(xiàn)污染，即刻使用支原體去除試劑進(jìn)行清除。

5.RAW 264.7收到貨，細(xì)胞不見

RAW 264.7收到貨，細(xì)胞不見這是因?yàn)镽AW 264.7 細(xì)胞貼壁較松，快遞運(yùn)輸路上受到顛簸，可能會脫落。脫落的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中不容易聚焦。可以把細(xì)胞放進(jìn)培養(yǎng)箱靜置2-4個(gè)小時(shí)就可以看到了。

如果靜置后看到的細(xì)胞仍偏少，請將瓶子里的培養(yǎng)基都轉(zhuǎn)移到離心管里，1200rpm(約250g)離心3分鐘，即可看到沉淀的細(xì)胞。

6.RAW 264.7細(xì)胞不貼壁怎么辦

RAW 264.7細(xì)胞不貼壁怎么辦將RAW 264.7細(xì)胞離心收集，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞放到新的培養(yǎng)瓶里之后，可能會出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)漂浮、不貼壁的情況。這種情況下，把細(xì)胞離心收集，用1mL培養(yǎng)基重懸，慢慢地，輕輕地吹打，直到細(xì)胞被吹成單細(xì)胞，就可以重新鋪板了。

RAW 264.7脫落后傾向于抱團(tuán)，抱團(tuán)時(shí)細(xì)胞是活著的，但很難貼壁。記得一定要把聚成團(tuán)的細(xì)胞吹散成單細(xì)胞，不然細(xì)胞很難重新貼壁。

7.RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)是怎樣

RAW 264.7細(xì)胞形態(tài)是怎樣RAW 264.7細(xì)胞被指定為粘附線并像單層一樣處理，但是培養(yǎng)物可以混合粘附和懸浮種群。

在培養(yǎng)RAW 264.7的初始階段，細(xì)胞附著并呈長方體狀，并帶有細(xì)長的延伸部分。隨著培養(yǎng)物變得更加密集，可能會有另一層圓形細(xì)胞附著在原始單層上。在極重的培養(yǎng)物中，細(xì)胞會釋放到培養(yǎng)基中。在重培養(yǎng)中，通常有附著細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

8.RAW 264.7細(xì)胞分化處理

RAW 264.7細(xì)胞分化處理AW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)過程中密度過大，培養(yǎng)基顏色發(fā)黃都易刺激細(xì)胞分化，分化的RA264.7細(xì)胞呈多角形，體積明顯增大，時(shí)常有較長的黑色觸角。

RAW 264.7細(xì)胞如何避免細(xì)胞分化

RAW 264.7細(xì)胞消化時(shí)不能用胰酶消化，消化會造成細(xì)胞分化，客戶可以用移液槍吹打，會比巴氏吸管方便一點(diǎn)。

RAW 264.7細(xì)胞分化處理

前面我們說到RAW 264.7不能用胰酶消化，許多實(shí)驗(yàn)室用細(xì)胞刮傳代，這是一種非常經(jīng)典好用的方法。在這邊我們推薦“吹打傳代”方法，其操作步驟簡單，也能更好地控制細(xì)胞分化率。

(一)吹打傳代操作步驟

1.輕拍幾下培養(yǎng)皿

2.用1ml 的槍或者巴氏管把細(xì)胞吹下來

3.細(xì)胞吹下來后轉(zhuǎn)移到15ml離心管

4.1200rpm(約250g)離心3min

5.去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞

6.按比例接種到新的培養(yǎng)皿中

(二)吹打傳代時(shí)機(jī)

1.當(dāng)細(xì)胞密度較低的時(shí)候，可能不太好吹下來。

2.當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%的時(shí)候，最容易吹下。

(三)操作注意事項(xiàng)

1.RAW 264.7細(xì)胞三天不傳代更容易分化，很難吹下，每一次接種密度都要控制好;

2.分化的細(xì)胞貼壁牢固，傳代的時(shí)候請勿強(qiáng)制性吹下這些細(xì)胞，只接種容易吹下的那些未分化細(xì)胞;

3.吹打的力度一定要輕，切勿暴力吹打;

4.細(xì)胞的貼壁性和培養(yǎng)器皿的材料也有關(guān)，有時(shí)RAW 264.7 會出現(xiàn)太容易吹下的情況，連分化細(xì)胞都貼壁較松，此時(shí)更適宜用巴氏管吹打;

5.培養(yǎng)時(shí)，無法保證100% 不分化，通過傳代可以將分化比例控制在一定范圍。