小鼠滑膜成纖維細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞分離自滑膜組織，滑膜組織是位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)面的內(nèi)襯結(jié)構(gòu)，各種關(guān)節(jié)內(nèi)疾病均會(huì)累及滑膜。而滑膜細(xì)胞是維持關(guān)節(jié)正常功能的重要組織結(jié)構(gòu)，同時(shí)在各種關(guān)節(jié)疾患中也是主要病變部位。骨關(guān)節(jié)炎(OA)以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)樘卣?，其病理改變累及關(guān)節(jié)的各個(gè)組成部分，但絕不僅局限于軟骨，還包括軟骨下骨、滑膜、半月板和韌帶。各組成部分的病理改變相互影響，相互作用，共同加速關(guān)節(jié)的退變。滑膜細(xì)胞是構(gòu)成滑膜層的最大細(xì)胞群體，是維持關(guān)節(jié)正常功能的重要組織結(jié)構(gòu)，它包埋在顆粒狀無(wú)定性的基質(zhì)中，基質(zhì)內(nèi)有分散的纖維分布?；び葾型(巨噬樣滑膜細(xì)胞)、B型(成纖維樣滑膜細(xì)胞)以及C型(樹(shù)突細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞)細(xì)胞組成。

小鼠滑膜細(xì)胞主要功能

① 滑膜細(xì)胞產(chǎn)生潤(rùn)滑液成分，并且與關(guān)節(jié)腔的吸收和血液/潤(rùn)滑液交換有關(guān);

② 滑膜細(xì)胞增生，表現(xiàn)為不依賴于支持物生長(zhǎng)，并且分泌大量的效應(yīng)分子來(lái)促進(jìn)炎癥和關(guān)節(jié)損壞;

③ 是自身自分泌和旁分泌網(wǎng)絡(luò)中效應(yīng)因子的一部分。

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞分離,鑒定及傳代方法步驟

主要試劑

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基、滑膜組織專用消化液、PBS緩沖液

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞分離操作步驟

1.滑膜組織的獲取

小鼠(5-10w)斷頸處死，置于 75%乙醇中消毒2min，剪開(kāi)雙后肢皮膚，用顯微外科手術(shù)剪刀和子在關(guān)節(jié)的周圍剪下滑膜組織(為白色海綿狀，圖 1A 所示)，需注意將其中“蛋黃樣”黃色圓物去除(圖 1B 中小圖所示)。轉(zhuǎn)移入含2mL DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿。

在該實(shí)驗(yàn)中，主要是采用髓關(guān)節(jié)周圍的滑膜組織，但如欲獲得更多的滑膜組織也可進(jìn)行以下操作：

取下雙后肢(不含足踝，應(yīng)保留所有的肌肉組織)，置于含2mLDMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在體視鏡下，用顯微外科手術(shù)剪刀和鑷子剪開(kāi)小鼠膽窩內(nèi)肌肉，剪下滑膜組織(圖1C 中箭頭2所示)，也需注意將其中“蛋黃樣”黃色圓物去除(圖1B 所示)，轉(zhuǎn)移入另一個(gè)含 2 mL DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。為獲取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，可在體視鏡下沿骨兩側(cè)打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔(圖1C 中箭頭3所示翻轉(zhuǎn)暴露關(guān)節(jié)腔，小心剝離關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織(圖1D 所示)。

2.滑膜組織的消化及 SF的培養(yǎng)

2.1 將修剪后的滑膜組織轉(zhuǎn)1 .4移至含0.5 mL滑膜組織專用消化液的 EP管中，剪碎成1mm3的塊。

2.2將 EP 管中平放置于 37℃搖箱中(200次/min)，振蕩消化60min;置于渦輪機(jī)上高速振蕩15 min 以保證細(xì)胞分離;

2.3 300Xg 離心5 min，吸棄上清

2.4 在超凈臺(tái)上加入滑膜成纖維細(xì)胞專用培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，選用 T75培養(yǎng)瓶

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)學(xué)鑒定

滑膜成纖維細(xì)胞在第 2 天即可見(jiàn)貼壁，3 d 后可進(jìn)行第1次換液，以后每3-4 天換液1次，約在1周時(shí)即可進(jìn)行第 1次傳代。1 d 時(shí)滑膜巨噬細(xì)胞數(shù)量最多，此后隨傳代次數(shù)增多而減少，至第 3 次傳代(第15-20 天)時(shí)滑膜巨噬細(xì)胞基本消失。

2. 標(biāo)志物檢測(cè)

用 Vimentin、CD90.2、CD54 和CD106 4 種細(xì)胞表面標(biāo)志物對(duì) SF的純度進(jìn)行分析。用 Vimentin 可以很好地進(jìn)行 SF的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，顯示其細(xì)胞純度大于95%。流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，Vimentin和 CD90.2標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度超過(guò)95%，而 CD54 標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度約為80%，但CD106 標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度僅為 23%。