原代細(xì)胞(primary cell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊。

原代細(xì)胞定義

原代細(xì)胞(primary culture cell)是指從機(jī)體的組織(如人組織、小鼠組織大鼠組織和兔組織等)經(jīng)蛋自酶或其它的方法獲得單個細(xì)胞并在體外進(jìn)行模擬機(jī)體培養(yǎng)的細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞生長緩慢，一般認(rèn)為，培養(yǎng)的原代的第1代細(xì)胞和傳代到第10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了，細(xì)胞的生長會出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡。

在人工條件下使其原代細(xì)胞生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。

原代細(xì)胞是接近和最能反映體內(nèi)生長特性的細(xì)胞，適用于藥敏試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。

研究中常用的細(xì)胞系/株系是現(xiàn)成的，我們只需要進(jìn)行細(xì)胞傳代和種子保存。然而，這些細(xì)胞系往往因長期體外培養(yǎng)而失去原有的生物學(xué)特性，對藥物治療的反應(yīng)差距越來越大。因此，越來越多的人選擇原代細(xì)胞。來源于胚胎、組織、器官和外周血，經(jīng)特殊分離方法制備的原代培養(yǎng)細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)，也稱為原代培養(yǎng)，是從供體獲得的組織細(xì)胞在體外的培養(yǎng)。

動物組織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散，獲得單個細(xì)胞，再生長于培養(yǎng)皿中。大多數(shù)組織可以制備原代細(xì)胞，但生長的快慢及難易程度不一。腎和睪丸最常用，甲狀腺細(xì)胞生長較慢，只用于某些特定的病毒如豬傳染性腸胃炎病毒的培養(yǎng)。

這類細(xì)胞生命周期有限，在有限的生命周期內(nèi)需掌握好細(xì)胞的生長空間，以保持細(xì)胞群中基因型和表型的一致性。

原代細(xì)胞的共性

原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA, RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用市場前景廣闊。

除了部分終末分化的細(xì)胞，一般的細(xì)胞都能傳代6-8代及以上，有些細(xì)胞基至更多，但是一般都建議采用3-4代以內(nèi)的細(xì)胞。

在原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中，-般是初次培養(yǎng)過夜后換液，以后每隔2-3天換一次液，以培養(yǎng)液的顏色為標(biāo)準(zhǔn)，一般變黃后就需換液。原代細(xì)胞的傳代前期一般是3-4天傳一次代，后期一般是4-6天傳一次代(前期指前三代，后期指三代后)。

不同類原代細(xì)胞的特性

1.終末分化的細(xì)胞

心肌細(xì)胞、型肺泡細(xì)胞(上皮細(xì)胞)、小腦顆粒細(xì)胞(神經(jīng)元)、脂肪細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞。終末分化細(xì)胞無增殖能力，建議使用新鮮的原代細(xì)胞。

2.上皮類細(xì)胞

血管內(nèi)皮、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、氣道上皮、結(jié)腸直腸上皮、小腸上皮、子宮頸上皮、胰腺導(dǎo)管上皮、腎上皮、腎小管上皮、前列腺上皮、乳腺上皮、甲狀腺上皮、角膜上皮細(xì)胞等。上皮類細(xì)胞大多都能增殖傳代6-8代，但多數(shù)上皮類細(xì)胞的生長伴隨著成纖維細(xì)胞的大量增殖，3-4 代后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞，建議使用原代或者3-4代以內(nèi)的傳代細(xì)胞。人體組織來源的上皮類原代細(xì)胞增殖能力較弱，建議選用原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

3.嗅球成鞘細(xì)胞

屬于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可增殖傳代，體外培養(yǎng)3-4代后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢生長細(xì)胞，建議使用原代或者3-4代以內(nèi)的傳代細(xì)胞。

4.骨骼肌、平滑肌細(xì)胞

可增殖傳代，至少10-12代 。

5.成骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

可增殖傳代，至少6-8代，但其生長伴隨有成纖維細(xì)胞的污染，3-4代后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢生長細(xì)胞，建議使用原代或者3-4代以內(nèi)的傳代細(xì)胞。

6.角質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞

均取自動物表皮，角質(zhì)細(xì)胞易分化，原代培養(yǎng)6-7天后逐漸分化并死亡。表皮組織中黑素細(xì)胞含量較少，原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞可增殖傳代，至少6-8代，3-4代后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢生長細(xì)胞，建議使用原代或者3-4代以內(nèi)的傳代細(xì)胞。

7.胰島細(xì)胞

可增殖傳代，至少8代，但其生長伴隨有成纖維細(xì)胞的污染，3-4代后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢生長細(xì)胞，建議使用原代或者3-4代以內(nèi)的傳代細(xì)胞。

8.肝細(xì)胞

原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞不易增殖，建議使用新鮮的原代細(xì)胞。

原代細(xì)胞分離

人或動物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細(xì)胞解離出來。

1.懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。

2.實(shí)體組織材料的分離方法

對于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法。

① 機(jī)械分散法

特點(diǎn)：簡便、快速,但對組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。

② 消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀)，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長。

Ⅰ酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開。

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，對膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。

除上述兩種最常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶

Ⅱ非酶消化法(EDTA消化法)

EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。

Ⅲ 消化分離法的操作步驟

剪切，加液漂洗，消化，棄去消化液，漂洗，機(jī)械分散

Ⅳ 消化分離法的注意事項(xiàng)

組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)

原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 [1] 最常用的原代細(xì)胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。分散細(xì)胞培養(yǎng)大致步驟為：將動物組織從機(jī)體中取出離散成單個細(xì)胞(常用胰蛋白酶)，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。

原代細(xì)胞的復(fù)蘇

1.取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

2.吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。

3.用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)其實(shí)與細(xì)胞系的培養(yǎng)無多大差別，針對不同的細(xì)胞會選擇不同的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.培養(yǎng)液選擇

根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn) 要求進(jìn)行培養(yǎng)液的選擇，最常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。

加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。

a.培養(yǎng)時間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以 上的時間，期間可換液或者傳代。

b.換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時關(guān)注細(xì)胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

2.細(xì)胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細(xì)胞圖

人成纖維細(xì)胞圖

這些細(xì)胞的狀態(tài)比較好，生長至80%~90%融合就可以傳代。

3.原代細(xì)胞的傳代、保存

傳一代后的細(xì)胞(也可以不傳代直接凍存)培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍存液配制:不同的細(xì)胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實(shí)驗(yàn)室也有自己的凍存方案，常見的方案有:

A: 10%DMSO+90%FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS

按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過夜)→液氮。

D：無血清凍存液

傳代：依椐細(xì)胞的生長狀態(tài)，生長的細(xì)胞1：2或1：3進(jìn)行傳代。

4.細(xì)胞培養(yǎng)過程無菌操作

正常的復(fù)蘇，換液和傳代操作，最后將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)即可

5.細(xì)胞鑒定

有時候我們獲取的原代細(xì)胞可能會有不是自己期望的細(xì)胞在里面，或者獲取的不是我們的目標(biāo)細(xì)胞。這個時候我們需要進(jìn)行細(xì)胞的鑒定。細(xì)胞鑒定需要購買特定細(xì)胞的表面標(biāo)志物抗體或者染色試劑進(jìn)行鑒定。

原代細(xì)胞試用的實(shí)驗(yàn)類型

原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。在這些應(yīng)用中幾乎都涉及了幾個最常見的且最基礎(chǔ)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如下:

1.細(xì)胞增殖檢測

常見檢測方法: CCK8檢測法，MTT檢測法，Brdu檢測法， Edu檢測法， 平板克隆形成

2.細(xì)胞周期檢測

常見檢測方法:流式檢測細(xì)胞周期，標(biāo)記有絲分裂百分率法

3.細(xì)胞凋亡檢測

常見檢測方法:流式檢測細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，活性氧檢測，Hoechst染色， 電鏡，TUNEL

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測

常見檢測方法:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)， Invasion實(shí)驗(yàn)。