SMMC-7721細(xì)胞取自人肝癌組織，采用靜置和旋轉(zhuǎn)管法培養(yǎng)11天細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)，首次傳代23天。SMMC-7721細(xì)胞AFP陽(yáng)性;用Northern Blot方法，未能檢測(cè)到SMMC-7721細(xì)胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表達(dá)，免疫缺陷小鼠體內(nèi)可成瘤。

基本信息

英文標(biāo)題：RAB6B is a potential prognostic marker and correlated with the remolding of tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma.

中文標(biāo)題：RAB6B是肝細(xì)胞癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物，并與腫瘤免疫微環(huán)境重塑相關(guān)

發(fā)表期刊：《Frontiers in Pharmacology》

影響因子：5.6

作者單位：東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院、連云港市第二人民醫(yī)院(連云港腫瘤醫(yī)院)、邢臺(tái)市癌癥控制研究所等

作者信息：Hao Peng，Erwei Zhu，Jitao Wang，Xuanlong Du，Chonggao Wang，Meng Yang，Yewei Zhang.

研究背景

● 肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)和致死率較高的類型。

● Ras相關(guān)結(jié)合蛋白(Rab)蛋白家族是Ras超家族小GTP酶中最大的家族，主要參與膜運(yùn)輸過(guò)程。

● RAB6B是Rab GTP酶家族的成員，在多種腫瘤中表現(xiàn)出調(diào)控異常。

● 目前，RAB6B在HCC中的臨床意義及其與免疫細(xì)胞和基質(zhì)浸潤(rùn)的相關(guān)性尚不明確。

研究方法

● 使用TIMER、HCCDB、UALCAN和HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢查了HCC中RAB6B mRNA和蛋白的表達(dá)。

● 通過(guò)cBioPortal和COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)分析了RAB6B的遺傳變異。

● 利用TIMER、TISIDB和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)探索了RAB6B與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的相關(guān)性。

● 基于LinkedOmics研究了RAB6B的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

● 通過(guò)GDSC和CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)分析了藥物的敏感性。

● 在HCC細(xì)胞系中用siRNA敲低RAB6B。

● 通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，使用流式細(xì)胞術(shù)比較細(xì)胞凋亡能力的差異，以及使用MTT評(píng)估體外藥物敏感性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：展示了RAB6B在HCC組織中的表達(dá)水平。

● TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，RAB6B在肝細(xì)胞癌(LIHC)組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。

● HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)中的六個(gè)HCC隊(duì)列表明，與鄰近的肝臟組織相比，RAB6B在HCC組織中高度表達(dá)。

● UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)表明，與正常肝臟組織相比，HCC組織中的RAB6B mRNA表達(dá)水平增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***p < 0.001)。

● TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)表明，50例HCC組織中的RAB6B表達(dá)水平高于其配對(duì)的鄰近正常肝臟組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***p < 0.001)。

● CPTAC數(shù)據(jù)集中的結(jié)果表明，HCC組織中的RAB6B蛋白水平高于正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***p < 0.001)。

● HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中的免疫組化(IHC)圖像顯示，RAB6B在HCC組織(右側(cè)圖像)中的表達(dá)高于正常肝臟組織(左側(cè)圖像)。

● 盒形圖表明，RAB6B的表達(dá)與HCC患者的T期顯著相關(guān)(*p < 0.05，ns = 無(wú)顯著性)。

● 盒形圖顯示，RAB6B的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(**p < 0.01)。

表格1：RAB6B表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者臨床特征的相關(guān)性。

● RAB6B的表達(dá)與患者的年齡無(wú)顯著相關(guān)性(P值0.4771)。

● RAB6B的表達(dá)與性別無(wú)顯著相關(guān)性(P值0.1847)。

● RAB6B的表達(dá)與AFP水平無(wú)顯著相關(guān)性(P值0.2226)。

● RAB6B的表達(dá)與腫瘤分期(I、II、III、IV期)有關(guān)，但僅與II期有關(guān)(P值0.0337)。

● RAB6B的表達(dá)與T分期(T1、T2、T3、T4)有關(guān)，但僅與T1期有關(guān)(P值0.0211)。

● RAB6B的表達(dá)與M分期(M0、M1)無(wú)顯著相關(guān)性(P值1)。

● RAB6B的表達(dá)與N分期(N0、N1)無(wú)顯著相關(guān)性(P值0.67)。

● RAB6B的表達(dá)與腫瘤分級(jí)(G1、G2、G3、G4)無(wú)顯著相關(guān)性(P值0.089)。

圖2：展示了RAB6B在HCC患者中的預(yù)后和診斷價(jià)值。

● Kaplan-Meier生存分析顯示，與低RAB6B表達(dá)的患者相比，高RAB6B表達(dá)的患者總體生存期(OS)和疾病特異性生存期(DSS)均較短(A和B)。

● 單因素COX分析揭示，T分期、M分期和RAB6B表達(dá)是影響HCC患者生存率的顯著因素(C)。

● 多因素COX分析表明，T分期和RAB6B表達(dá)是HCC患者中獨(dú)立的預(yù)后因素(D)。

● ROC曲線用于評(píng)估高RAB6B水平對(duì)HCC患者的診斷價(jià)值(E)。

● 時(shí)間依賴性生存ROC曲線分析用于預(yù)測(cè)1年、3年和5年的生存率(F)。

● 結(jié)合臨床病理特征和RAB6B水平的Nomogram被構(gòu)建，用于預(yù)測(cè)TCGA數(shù)據(jù)集中1年、3年和5年的預(yù)后概率(G)。

圖3：展示了HCC中RAB6B突變的景觀。

● 通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)，可以了解HCC中RAB6B的遺傳變異情況。

● TCGA數(shù)據(jù)顯示了RAB6B在HCC中的突變頻率。

● RAB6B的拷貝數(shù)與mRNA表達(dá)之間存在相關(guān)性。

● RAB6B突變?cè)贖CC中涉及多個(gè)蛋白質(zhì)域。

● 直方圖和餅圖展示了HCC中RAB6B突變的分布情況。

圖4：展示了RAB6B表達(dá)與HCC中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

● RAB6B表達(dá)與HCC患者的免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和估計(jì)評(píng)分呈正相關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與HCC中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與HCC中不同類型的免疫細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)。

● RAB6B表達(dá)與HCC中的免疫亞型有關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與HCC中的分子亞型有關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與HCC中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞的豐度相關(guān)，且這些細(xì)胞與患者的生存率有關(guān)。

圖5：展示了RAB6B表達(dá)與免疫相關(guān)分子和細(xì)胞的關(guān)系。

● RAB6B在CD8+T細(xì)胞中富集。

● RAB6B表達(dá)與多種免疫檢查點(diǎn)分子正相關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與TGFB1和IL10正相關(guān)。

● RAB6B與多種免疫相關(guān)分子、細(xì)胞因子和受體相關(guān)。

● RAB6B表達(dá)與Treg細(xì)胞、MDSC和M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)正相關(guān)，與M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)負(fù)相關(guān)。

圖6：展示了RAB6B相關(guān)基因的功能富集分析。

● 河圖顯示了與RAB6B共表達(dá)的HCC基因的輪廓，包括高表達(dá)和低表達(dá)的基因。

● 熱圖展示了與RAB6B表達(dá)正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因，揭示了RAB6B在HCC中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

● KEGG分析揭示了HCC中RAB6B共表達(dá)基因的功能通路，可能涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝、腫瘤發(fā)生等。

● GO分析從生物過(guò)程、細(xì)胞組分分子功能等多個(gè)角度對(duì)RAB6B共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集，提供了對(duì)RAB6B功能影響的多維度理解。

圖7：展示了癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)浸潤(rùn)與RAB6B表達(dá)在HCC中的相關(guān)性。

● RAB6B的表達(dá)與HCC中CAF的浸潤(rùn)水平正相關(guān)。

● RAB6B的表達(dá)與CAF的多個(gè)標(biāo)記物以及膠原蛋白相關(guān)蛋白的表達(dá)正相關(guān)。

● RAB6B的上調(diào)與膠原蛋白的形成和細(xì)胞外基質(zhì)組織的基因集富集相關(guān)。

● 通過(guò)HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了RAB6B的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，這可能揭示了RAB6B在HCC發(fā)展中的潛在作用機(jī)制。

圖8：展示了RAB6B表達(dá)與藥物反應(yīng)的相關(guān)性。

● RAB6B mRNA表達(dá)與GDSC和CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)中列出的前30種藥物的敏感性相關(guān)。

● 該分析可能揭示了RAB6B表達(dá)水平與癌癥對(duì)多種藥物治療的反應(yīng)之間的關(guān)系。

● 通過(guò)點(diǎn)圖展示，可以觀察到RAB6B mRNA表達(dá)水平與藥物敏感性之間的潛在聯(lián)系。

圖9：展示了敲低RAB6B對(duì)HCC細(xì)胞增殖、凋亡和藥物敏感性的影響。

● qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，不同HCC細(xì)胞系中存在RAB6B mRNA表達(dá)。

● 使用siRNA轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞后，RAB6B的表達(dá)被有效敲低。

● 敲低RAB6B后，HCC細(xì)胞的增殖被抑制。

● 敲低RAB6B也導(dǎo)致HCC細(xì)胞的凋亡增加。

● 敲低RAB6B的HCC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加。

● 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都展示了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，其中p值小于0.05、0.01和0.001分別表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

研究結(jié)論

● RAB6B在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中高表達(dá)。

● RAB6B高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。

● RAB6B通過(guò)招募免疫細(xì)胞和誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞疲勞，促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成。

● 對(duì)RAB6B的基因組變異、功能富集和潛在靶向藥物進(jìn)行了分析。

● 體外實(shí)驗(yàn)證明敲除RAB6B能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并提高對(duì)順鉑的敏感性。