MC3T3-E1 Subclone 14細胞成骨誘導引言

MC3T3-E1subclone 14細胞株是從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一系列亞克隆。 從含抗壞血酸培養(yǎng)基生長的成骨細胞中選擇高或低成骨細胞分化、礦化的亞克隆。 MC3T3亞克隆4(ATCC CRL-2593)和MC3T3亞克隆14(ATCC CRL-2594)在抗壞血酸和3到4mM無機磷酸鹽中生長表現(xiàn)出高水平的成骨細胞分化。 它們10天后形成一個礦化良好的細胞外基質(zhì)(ECM)。

MC3T3亞克隆24(ATCC CRL-2595)和MC3T3亞克隆30(ATCC CRL-2596)在抗壞血酸中生長表現(xiàn)出很差的成骨細胞分化。 不形成ECM， 可以作為亞克隆4和14的陰性對照。 礦化的亞克隆選擇的表達作為成骨細胞標記的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨鈣素(OCN)，和甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白受體的mRNA。

高或者低的分化潛能的亞克隆在培養(yǎng)中生產(chǎn)出相似數(shù)量的膠原質(zhì)，表達可比較的基本水平的mRNA編碼Osf2/Cbfa1，一種成骨細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亞克隆形成與骨類似的形成小骨的編織骨，低分化細胞只是產(chǎn)生纖維組織。 這些細胞系是研究體外成骨細胞分化的好模型，尤其是ECM信號。 它們和原代培養(yǎng)顱頂成骨細胞的行為類似。

MC3T3-E1 Subclone 14細胞成骨誘導分化實驗步驟

實驗準備

MC3T3-E1 Subclone 14小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14細胞

MC3T3-E1 Subclone 14細胞成骨誘導分化實驗步驟(以12孔板為例)

1.MC3T3-E1 Subclone 14細胞正常培養(yǎng)，細胞融合度達到80%~90%時，即可用胰酶消化，計數(shù);；

2.按2~3×104 cells/cm2的細胞密度接種在12孔板中(具體接板數(shù)量以實際預實驗情況為準)，每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14細胞完全培養(yǎng)基；

3.將接種好的MC3T3-E1 Subclone 14細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

4.誘導試劑配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導分化培養(yǎng)基由基礎培養(yǎng)基、血清和添加物三部分組成，使用前將各組分混勻后即可得到成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；

5.當細胞融合度達到80%~95%時，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向12孔板中加入1 mL預熱的MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；

6.每隔48~72h更換預熱的新鮮的成骨誘導分化完全培養(yǎng)基；

7.誘導培養(yǎng)2~4周，期間注意觀察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定是否進行下一步染色鑒定。

MC3T3-E1 Subclone 14細胞誘導分化結(jié)果展示

MC3T3-E1 Subclone 14誘導過程中注意事項

開始誘導時的細胞密度可控制在90%~95%，注意避免細胞過飽和導致細胞卷邊漂起或者狀態(tài)不佳。

實驗開始前確保細胞狀態(tài)，盡可能使用早代次的細胞開始實驗。

細胞鋪板需均勻，鋪板不均勻可能導致分化不均勻、分化比例低、分化過程中細胞漂浮等問題。

由于誘導時間較長，為防止細胞脫落，可提前使用明膠包被培養(yǎng)板。

細胞換液或者添加誘導分化培養(yǎng)基時需注意：誘導分化培養(yǎng)基提前37℃復溫；換液時可留一點原液作為緩沖，加液時槍頭沿壁逐滴加入，操作應迅速，盡量避免在超凈臺內(nèi)操作時間過長，同時手法要輕柔;這樣對細胞的沖擊最小，否則極易導致細胞卷邊飄起。

避免長時間將細胞拿出培養(yǎng)箱外進行觀察，并盡量減少培養(yǎng)板的晃動，以防細胞卷邊或漂浮。

拍照時可留少量PBS，減少光圈的出現(xiàn)，以便呈現(xiàn)更好的拍攝效果。