很多科研小伙伴在培養(yǎng)細胞過程中，可能都有過這樣的經歷：辛苦呵護的細胞，怎么也不愿意貼壁;貼壁了又很容易成塊或者成團掉下來;原本貼壁的細胞，復蘇后細胞不貼壁了等各種細胞不貼壁問題，那么遇到這些問題，該如何解決?

培養(yǎng)細胞時如果出現不貼壁現象，其原因是多方面的，在分析細胞不貼壁的原因及解決方法之前，我們先來看下什么是貼壁細胞?貼壁細胞原理?細胞貼壁和什么有關?為啥你的細胞不愿貼壁呢?如何促進細胞貼壁?

細胞不貼壁原因分析及解決方法

根據細胞特性分類

1. 懸浮細胞(Suspension Cell)

細胞生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長，如淋巴細胞。

2. 貼壁細胞(Adherent Cell)

在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的粘附因子才能在該表面生長增殖的細胞。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細胞或上皮樣細胞。

細胞形態(tài)

3.兼性貼壁細胞

有些細胞并不嚴格地依賴支持物，它們既可以貼附于支持物表面生長，但在一定條件下，也可在培養(yǎng)基中呈懸浮狀態(tài)生長。

貼壁細胞分為：上皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型，在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其他形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動。常見的貼壁細胞有成纖維細胞、骨骼組織(骨及軟骨)、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺皮膚、神經膠質細胞、內分泌細胞、黑色素細胞以及各種腫瘤細胞等。

體外培養(yǎng)貼壁細胞特點

貼附并伸展，是多數體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。細胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細胞形態(tài)改變是細胞內骨架(真核細胞中的蛋白纖維網架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系)本身和細胞外基質共同作用的結果。培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣，當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。細胞附著于底物時并非一種需要能量的過程，一般認為與電荷有關。據資料記載，37℃時在2min內細胞之間即可形成鍵，該鍵可對0.01%胰蛋白酶起作用且僅發(fā)生于細胞間，細胞與底物之間則無;8min后才有穩(wěn)定的鍵形成。

貼壁細胞(除腫瘤細胞外)在體外培養(yǎng)條件下，完成貼壁后均為單層生長，原因是貼壁細胞有接觸性抑制的特點。一般認為接觸抑制是細胞間的一種識別作用，對于動物細胞的形態(tài)形成與穩(wěn)定具有重要性的作用。由于貼壁細胞的一面是緊貼在培養(yǎng)瓶上的，如果其上方存在細胞與其相粘附，那么下方的細胞很快就會缺乏營養(yǎng)——餓死。

接觸抑制

1954年，由艾伯克龍比發(fā)現，一些細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂現象，將其命名為接觸性抑制(Contact Inhibition)，后來證實接觸性抑制普遍存在于貼壁細胞之間。

接觸抑制的原理：細胞膜上有糖類和蛋白質共同構成的糖蛋白，也叫做糖被，它在細胞上起識別作用，當細胞增殖到一定程度，挨在一起時，糖蛋白就會識別這種信號，并且使細胞停止繁殖。

單層生長

細胞為什么要貼壁

首先并不是所有的細胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實體組織器官的細胞都會貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細胞(絕大部分細胞)通過重力作用會沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細胞要生存必定得改善這個環(huán)境，也是貼壁的主要原因——分泌細胞外基質和粘附因子(Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM)，改善底面的結構，然后很自然就貼附在底面上了。

細胞粘附分子

是眾多介導細胞間或細胞與細胞外間相互接觸和結合分子的統(tǒng)稱。

細胞外基質

是由動物細胞合并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子。

二者大多數均為糖蛋白，因此具有較強的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關乎細胞是否有這種能力，也與有無合適的底物(培養(yǎng)瓶)有關。

原理圖

密度小于水的細胞，如脂肪細胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細胞貼壁是適應環(huán)境的一種反應。

細胞貼壁原理及相關因素

大多數的哺乳動物細胞在體內和體外均附著于一定的底物而生長，在體外時這些底物可以是其他細胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過程：細胞首先分泌細胞外基質，這種細胞外基質黏附在支持物的表面(培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面)。然后，細胞通過其表面表達的黏附因子與這些細胞外基質結合。

貼壁過程

一些特殊的促細胞附著物質(如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子等)可能參加細胞的貼附過程。這些促細胞附著因子均為蛋白質，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過程中，這些帶陽電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細胞再與已吸附的有促貼附物質的底物附著，以后細胞將伸展成其原來的形態(tài)。所以細胞貼壁與否和細胞本身分泌細胞外基質的能力以及細胞本身表達的黏附分子的數量有關，也與培養(yǎng)皿壁的表面結構有關。

在細胞培養(yǎng)過程中會出現這樣或那樣的問題，這些問題從細胞生長角度來說，針對細胞不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，我們做以下分析并提出相對應的解決方法。

細胞不貼壁的一些原因

1) 胰酶消化時間把控不當：消化不夠細胞本身就是成團的;若胰酶處理太久，容易造成細胞膜蛋白損傷，使細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。

2) 缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細胞的貼壁效果會下降很多。

3) 支原體或細菌的污染。

4) 培養(yǎng)液配制、儲存不當，如pH值過堿，Gln量太少等原因。

5) 復蘇的細胞本身狀態(tài)不好，已經老化，失去貼附性。

6)接種細胞數目太少，無法分泌足夠的細胞外基質。

7) 復蘇時處理速度太慢，復蘇過程不當。

如何促進細胞貼壁

1)適度消化細胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

2)最好用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶，那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進行蝕刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3)正確配制消化液或培養(yǎng)液。

4)使用合適的細胞外基質或貼壁試劑。

5) 復蘇新的細胞。

6)傳代接種一定要鋪的均勻，避免細胞抱團生長。

7)細胞傳代24小時之內，最好不要晃動，以免影響貼壁。

8) 體內上皮細胞生長在膠原構成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的3T3細胞為飼養(yǎng)層，另外降低pH、Ca2+含量和溫度，均有利于上皮細胞生長。

懸浮細胞成簇可能原因

1)培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子;

2)支原體污染;

3)蛋白酶過度消化使得細胞裂解;

4)DNA污染 。

懸浮細胞成簇解決方法

1)用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕巧吹吸細胞獲得單細胞懸液;

2)分離培養(yǎng)物，檢測支原體;

3)用DNaseI處理細胞。

培養(yǎng)細胞生長緩慢可能原因

細胞長得慢是細胞培養(yǎng)過程中比較常見的問題，一般來說，細胞活力和濃度一直是細胞健康的標志，細胞長得慢的話，活力和濃度可能都會直線下降。

1)由于更換不同培養(yǎng)液或血清;

2)培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞;

3)培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染;

4)試劑保存不當;

5)接種細胞起始濃度太低;

6)細胞已老化;

7)支原體污染 。

培養(yǎng)細胞生長緩慢解決方法

1)比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗，讓細胞逐漸適應新培養(yǎng)液;

2)換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補加谷氨酰胺及生長因子;

3)用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現污染，丟棄培養(yǎng)物;

4)血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內用完;

5)增加接種細胞起始濃度;

6)換用新的保種細胞。細胞老化(cellular aging)是細胞隨生物體年齡增長而發(fā)生退行性變化的綜合，如果傳代前細胞已匯合就會導致其失去黏附性。可以復蘇新的保種細胞，重新進行培養(yǎng)。

7)分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

培養(yǎng)細胞生長不好可能原因

1)細胞本身的狀態(tài);

2)細胞傳代次數多，細胞老化;

3)細胞的接種量：接種量過低，細胞生長緩慢;

4)細胞傳代時間過晚：細胞中毒，影響傳代后的細胞生長;

5)胰酶消化時間過長或過短：時間過長，細胞死亡;時間過短，細胞未完全分離而成團，細胞死亡;

6)細胞的凍存與復蘇：慢凍速融;

7)污染：支原體污染、霉菌污染;

8)培養(yǎng)基或血清;

更換血清或培養(yǎng)基之前未進行驗證;

選擇的培養(yǎng)基是否合適;

培養(yǎng)基配制是否準確無誤。

9)培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應是否正常;

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確。

培養(yǎng)細胞生長不好解決方法

根據以上可能原因，做出針對性的解決方案

1)注意細胞的本身狀態(tài)：如傳代次數、接種量等;

2)避免產生污染(用正規(guī)、合法、可溯源的血清);

3)要用合適的血清或培養(yǎng)基，最好經過驗證;

4)注意實驗室的環(huán)境。細胞對環(huán)境比較敏感，如果操作人員不注意衛(wèi)生、或工作環(huán)境及實驗器材出現污染都會導致細胞間的交叉污染，出現不貼壁現象。如果發(fā)現支原體污染，及時丟棄培養(yǎng)物。

培養(yǎng)細胞死亡可能原因

1)培養(yǎng)箱內無CO2;

2)培養(yǎng)箱內溫度波動太大;

3)細胞凍存或復蘇過程中損傷;

4)培養(yǎng)液滲透壓不正確;

5)培養(yǎng)液中有毒代謝產物堆積 。

培養(yǎng)細胞死亡解決方法

1)檢測培養(yǎng)箱內CO2;

2)檢查培養(yǎng)箱內溫度;

3)取新的保存細胞種;

4)檢測培養(yǎng)液滲透壓;

5)換入新鮮培養(yǎng)液。

細胞產品是我們做實驗研究的基礎，一支小小的細胞，關乎我們各種實驗的成功與否，細胞的”小事情“，在實驗中都是”大事情“，如果你的細胞出現生長緩慢、不貼壁等情況，那你可要注意了，這就是細胞狀態(tài)不好的信號，要及時“挽救”，不然很有可能細胞就瀕臨死亡。

總之，養(yǎng)細胞需要耐心，要溫柔，使用品質良好的細胞株和培養(yǎng)基是減少污染的最好方法，同時也是保證細胞生長良好的前提。