二甲基亞砜(DMSO)是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑。在深低溫(零下200度)保存細(xì)胞時(shí)凍存過程中，為防止細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷，有必要使用含有DMSO冷凍保護(hù)劑。DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩凍存過程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少細(xì)胞損傷。

DMSO是目前最常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，那么細(xì)胞凍存時(shí)DMSO和血清比例配制是多少?

一般使用時(shí)終濃度控制在5~10%，最佳濃度取決于細(xì)胞類型。

一般來(lái)說，存活率比較高的細(xì)胞系，培養(yǎng)基、血清、DMSO按照7：2：1的比例新鮮配制使用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，至5×10^6 ~ 1×10^7 cells/mL，然后1~1.5mL/管分裝凍存。

對(duì)于存活率較低的細(xì)胞系，或者需要長(zhǎng)時(shí)間保存的細(xì)胞系，可以增加凍存液中的血清濃度，血清和DMSO按9：1的比例配制。

另外，還有商品化的無(wú)血清凍存液可以選擇，不需要預(yù)先配制。一般會(huì)含有多種保護(hù)劑成分，適用于特別珍貴的細(xì)胞的保存，例如干細(xì)胞、分離后的免疫細(xì)胞等等。

細(xì)胞凍存操作步驟

1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍；

2.加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中消化；

3.待消化到位后加入適量血清或完全培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min；

4.配制凍存液，待細(xì)胞離心后去上清，加入凍存液重懸，轉(zhuǎn)移到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)；

5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

細(xì)胞凍存細(xì)節(jié)注意

1.凍存步驟中包含了消化的大部分步驟。

2.凍存液常規(guī)配比為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，如果細(xì)胞比較珍貴，可以調(diào)整為血清：DMSO=9:1;

3.如果沒有程序降溫盒，可以將凍存細(xì)胞依次放于4度1h，-20度2h，-80過夜，大部分細(xì)胞也可以適應(yīng)，但原代細(xì)胞不建議這么處理;

4.凍存細(xì)胞儲(chǔ)存在-80度中通常不建議超過半年，液氮中通常不建議超過2年;

5.細(xì)胞如果是第一次養(yǎng)，建議至少凍存兩個(gè)批次以上，以盡量避免因?yàn)閮龃鎲栴}導(dǎo)致細(xì)胞絕種;

另外，還有一些是無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞，也不能添加血清，這時(shí)就用無(wú)血清培養(yǎng)基(根據(jù)細(xì)胞特性定制的培養(yǎng)基)加入5-10%的DMSO來(lái)凍存。

細(xì)胞類型和細(xì)胞株個(gè)體特性。不同細(xì)胞有其凍存條件，不盡相同，需參考說明書和文獻(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凍存后狀態(tài)不佳，需要自己摸條件，或考慮污染和培養(yǎng)條件問題。