產品描述

肝實質細胞是肝功能的基本組成單位，大約占肝臟體積及數量的80%左右，肝實質細胞具有多方面的功能，例如：蛋白質的合成和儲存、分泌膽汁和解毒物質等。體外培養(yǎng)的肝實質細胞是研究肝臟能量代謝、物質合成、藥理毒性學良好模型。試劑盒采用二步灌流法，使得原代肝實質細胞從在體肝臟中消化，結合細胞純化液使用可快速純化得到小鼠肝實質細胞。使用本試劑盒提取所得的小鼠肝原代實質細胞純度>90.0%，純化后可直接進行RT-qPCR、Western blot等基本生物學實驗，貼壁后可進行藥理、病理、毒理學、免疫染色等實驗操作。

適用范圍

該試劑盒適用于C57BL/6J、BALB/c等不同型號4周齡以上小鼠的原代肝實質細胞提取試劑盒。

運輸和存儲條件

2-8 ℃保存與運輸，保質期為參考下表。所有組分開封后，有效期為 6-8 周，建議盡快使用。

配套培養(yǎng)基信息

表1. 試劑盒組成信息

分離步驟

實驗前準備

將小鼠肝實質灌注液Ⅰ、灌注液Ⅱ置于水浴鍋中加熱至37℃，備用。實驗需自備注射器、靜脈留置針、手術器械、75 μm過濾篩、離心管若干。

一、肝臟灌注

1.麻醉并且固定小鼠，酒精噴灑清洗腹部。

2.剪開小鼠腹腔，沿肝臟上方剪開胸腔隔膜，使上腔靜脈暴露，用止血鉗夾住上腔靜脈。

3.撥開小鼠腸組織，暴露小鼠下腔靜脈和肝門靜脈，在下腔靜脈的位置插入靜脈留置針并固定好位置，輕輕拔出針芯，拔出時針管處有回血，此時外套軟管留在血管內，進行灌注。

4.將裝有肝實質灌注液Ⅰ的注射器與靜脈留置針相連接，輕輕推動注射器，灌注液 Ⅰ 緩慢灌入，可見肝臟充盈，此時剪開門靜脈引流，保持灌流速度在5 mL/min至排盡肝臟內血液、肝組織呈現蠟黃色為止。

5.換上肝細胞灌注液 Ⅱ，低速(3 mL/min)灌流，并節(jié)律性擠壓門靜脈切口(擠壓5-10s左右，間隔30s-1min,讓肝臟充盈，提高消化率)，持續(xù)消化5-15min不等，消化肝臟直至用棉簽按壓肝臟有塌陷感或者部分透明感，條紋樣的裂紋。

6.將肝臟沿著膈肌周圍整個剪下來，轉移到一個裝有細胞洗液的培養(yǎng)皿中。在超凈臺中用鑷子去除膽囊和肝臟外的包膜，輕輕抖動組織使肝實質細胞如流沙狀流出，未完全分散的部分用鑷子輕輕撥散至細胞洗液中。

二、肝實質分離純化

1.用細胞洗液潤洗75 μm篩網，將上述步驟中的培養(yǎng)皿內的細胞濁液用寬頭吸頭或者巴氏管移至篩網上方過濾。

2.4℃、50 xg離心5分鐘。

3.小心棄去上清(低速離心后，肝實質細胞以松散的方式沉在底部，棄上清時切勿吸力過大或者直接傾倒上清)，加入15 mL細胞洗液，用寬頭吸頭或者巴氏管輕輕重懸沉淀。

4.重復步驟2，小心棄去上清，加入5 ml細胞洗液重懸細胞沉淀。

5.依據細胞活率和數量配置30%-50%的活細胞純化液(純化液濃度越高，得到的肝實質細胞活性越好，但與此同時，得到的細胞數量會減少，需要依據實驗進行取舍，如配置30% 細胞純化液配方為：細胞純化液：分離純化稀釋液 = 3:7)。將細胞懸液小心添加至兩倍體積的細胞純化液面上，細胞懸液與細胞純化液間應產生明顯分層。

6.400 x g、4 ℃離心10分鐘(使用水平轉子，加速度減速度均為最低)。

離心完畢后離心管底部的沉淀即為純化后的肝實質細胞，用貼壁培養(yǎng)基重懸。

三、肝實質分離純化

1.肝實質細胞種板前預先用 Ⅰ 型鼠尾膠原蛋白(以下簡稱鼠尾膠)鋪至培養(yǎng)器皿底部包被0.5-2 h(最長不超過6 h)，吸盡鼠尾膠，鼠尾膠可回收使用1-2次。

2.使用1 × PBS 清洗皿底后吸去PBS。

3.將細胞懸液按照3 x 105/ml細胞密度鋪至鼠尾膠包被的培養(yǎng)器皿中，轉移至細胞培養(yǎng)箱中。

4.4 h后顯微鏡下觀察，肝實質細胞呈較大圓形、有明顯雙核結構，將培養(yǎng)器皿內的貼壁培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基。

注意事項

1.肝臟離體后建議在冰上操作，分散肝實質細胞時應避免使用尖頭吸頭、過度重懸等操作導致細胞機械損傷。

2.肝實質細胞在貼壁2-3天后分化明顯，建議在3天內完成實驗。

3.肝實質細胞為不可傳代細胞，禁止使用胰酶等消化酶處理肝實質細胞。

4.小鼠肝實質灌注液 Ⅱ 中含有微生物生長所需的營養(yǎng)成分，請在超凈工作臺內打開，按照所需要量分裝，并且用封口膜封住瓶口，即取即用，以避免污染。