產(chǎn)品描述

原代肝實質(zhì)細胞(Hepatocytes)是高度分化的細胞，在體外培養(yǎng)中，貼壁后呈較大圓形、有明顯的雙核或多倍體核，培養(yǎng)2-3天后，細胞形態(tài)開始分化，伸出細長的細胞枝干，呈不規(guī)則的多邊形。肝細胞具有豐富的酶系及多種特異性功能。體外分離和培養(yǎng)的肝實質(zhì)細胞被廣泛用于病理學、藥代動力學、毒理學和致癌作用等基礎實驗研究。凍存肝細胞在- 196℃下保存， 可更好地保護細胞完整性和功能，減少細胞死亡和變性的風險。

適用范圍

本說明書適用于凍存懸浮和貼壁原代肝實質(zhì)細胞的解凍、離心、重懸、計數(shù)及接種/鋪板等相關信息，請嚴格參照說明書操作。

運輸和存儲條件

(1)運輸條件：干式液氮罐運輸，國內(nèi)現(xiàn)貨 2~3 天即可送達。

(2)儲存條件：液相液氮罐或氣相液氮罐長期保存，若存儲于液相液氮罐，請保障細胞在液氮表面以下。

配套培養(yǎng)基信息

表1. 試劑盒組成信息

細胞復蘇前準備事項

一、培養(yǎng)基預熱

培養(yǎng)基在使用前請于 37℃恒溫環(huán)境(如水浴鍋、恒溫箱)中預熱 30 min及以上，保證培養(yǎng)基達到 37℃。預熱完成后 75%酒精消毒轉(zhuǎn)移至生物安全柜中使用。

二、細胞培養(yǎng)板包被(貼壁肝實質(zhì)細胞)

貼壁肝實質(zhì)細胞鋪板之前，為了使肝實質(zhì)增強肝實質(zhì)細胞與培養(yǎng)板表面的粘附作用和維持肝實質(zhì)細胞形態(tài)穩(wěn)定，請使用I型鼠尾膠原蛋白包被液包被培養(yǎng)器皿底部。不同培養(yǎng)器皿使用包被劑的推薦體積請查找下表，37℃、 CO2培養(yǎng)箱孵育包被 0.5～2 小時(最長不超過 6小時)

表2. 推薦包被劑體積

細胞復蘇步驟

1.從液氮罐中取出細胞凍存管，立即置于 37℃水浴中(注意水面盡量沒過凍存液面，但不可接觸凍存管蓋)。

2.輕輕晃動凍存管約 1min 45s(時間供參考)直至管中保留約黃豆大小的冰晶，75% 酒精消毒凍存管表面，快速轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。

3.迅速將凍存管中液體一次性倒入已預熱的復蘇培養(yǎng)基中。

4.吸取 1mL 復蘇培養(yǎng)基潤洗凍存管內(nèi)壁(2~3 次)，潤洗后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至步驟 3 離心管中。

5.擰緊離心管蓋，緩慢上下顛倒離心管 2 次，混勻細胞懸液。

6.室溫離心，小鼠肝實質(zhì)細胞離心條件為50g 、2min ，升速設置為 5 ，降速設置為 1 ，關閉剎車模式。

【注】升降速可根據(jù)離心機型號設置，保證總離心時長不超過 5min。

7.使用移液管或巴氏吸管小心移除上清液(請勿直接傾倒上清，避免損失細胞)，請保留小部分體積的上清，使得吸頭或吸管不接觸到細胞沉淀。

8.細胞重懸：請依據(jù)肝實質(zhì)細胞的具體類型選擇相應培養(yǎng)基進行重懸與定容，懸浮肝實質(zhì)細胞選用肝實質(zhì)維持培養(yǎng)基， 貼壁肝實質(zhì)細胞選用肝實質(zhì)貼壁培養(yǎng)基。加入 2mL 相應的培養(yǎng)基，輕彈離心管底將細胞重懸并定容至 3mL ，此過程禁止劇烈震蕩以及反復吹打。

【注】①重懸培養(yǎng)基體積可根據(jù)細胞數(shù)量而定，避免細胞密度過低；②為減少機械損傷，可蓋緊離心管蓋后，輕輕順/逆時針旋轉(zhuǎn)離心管，重懸細胞。

9.細胞計數(shù)：可選擇臺盼藍染色或 AO/PI 染色，測定活細胞數(shù)目和細胞活率。如鋪板前等待時間過長，可將細胞于 4℃短暫保 存(不超過 1h)。

【注】細胞從解凍開始到接種到培養(yǎng)板，請盡量在 30 分鐘內(nèi)完成操作轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱孵育。

細胞培養(yǎng)步驟

懸浮肝實質(zhì)細胞 Suspension Hepatocytes

1.根據(jù)細胞計數(shù)所得的細胞數(shù)量與活率，結(jié)合實驗所需細胞濃度，計算所需的細胞懸液體積。

2.進行懸浮培養(yǎng)實驗，若不立即使用，請將細胞懸液短暫置于 4℃。

貼壁肝實質(zhì)細胞 Plateable Hepatocytes

1.根據(jù)細胞計數(shù)所得的細胞數(shù)量和活率，按活細胞數(shù)1.5×105 cells/cm2 接種到I型鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)器皿中。

2.使用鋪板培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋至適當接種濃度。

3.輕輕搖勻細胞懸液, 用微量移液器/多通道移液器吸取適量細胞懸液接種至已包被的細胞培養(yǎng)器皿中(棄包被液)，若接種到多孔板中，請保證孔板內(nèi)復孔的細胞數(shù)量盡量相同。

【注】步驟 2 、3 操作過程中，請盡量避免使用 1ml 以下量程的移液器，避免對細胞造成機械損傷。

4.按照“十字法”混勻培養(yǎng)板中的細胞。為達到最適的貼壁效果，顯微鏡觀察并保證細胞在培養(yǎng)板中均勻分布?；靹蚝髮⑴囵B(yǎng)板 放入細胞培養(yǎng)箱中，小鼠肝實質(zhì)細胞靜置貼壁 4～6 小時。

5.顯微鏡下觀察并拍照細胞形態(tài)與貼壁情況，細胞貼壁后，立即將鋪板培養(yǎng)基更換為細胞維持培養(yǎng)基，并可進行 后續(xù)實驗。

6.細胞培養(yǎng)換液：為保證細胞體外培養(yǎng)的營養(yǎng)供給和代謝廢物清除，建議每 48h 進行一次完全換液。

注意事項

(1)使用前請仔細閱讀說明書，建議嚴格參照本說明書進行肝實質(zhì)細胞的復蘇操作。若需技術(shù)支持，歡迎隨時致電。

(2)收到細胞后，請快速查驗細胞包裝是否完好無損、運輸溫度是否符合要求，并將裝有細胞的凍存管迅速轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

(3)為保證復蘇后細胞活率，復蘇過程中請輕柔操作，避免機械損傷導致細胞活率下降。

(4)原代肝實質(zhì)細胞特性敏感、生長條件嚴格，因此推薦使用逸漠配套的培養(yǎng)基，并且按照說明書操作。

(5)運輸和存儲期間以及取用解凍前，請避免將原代肝實質(zhì)細胞置于非液氮環(huán)境下。