產(chǎn)品介紹

γδT細胞具有在體內快速反應的特性，在受到刺激時，會先于αβ-T細胞釋放促炎性細胞因子(IFN-γ和TNF-α等)。γδT細胞能夠激活NK細胞的腫瘤細胞毒作用，與DC細胞互刺激成熟， APC細胞抗原呈遞的功能，激活αβ-T細胞的免疫效應， γδT細胞的殺傷作用具有非MHC限制性，廣泛的殺瘤譜，已知對至少十幾種腫瘤細胞有殺傷作用。γδT細胞在人外周血含量很少(1-5%)，本產(chǎn)品能夠將外周血中的單個核細胞大規(guī)模擴增成γδT細胞，具有擴增效率高，目的細胞百分比高的特點，起始單個核細胞經(jīng)過14天培養(yǎng)，γδT細胞絕對數(shù)量最高可擴增達到1000倍，其純度最高可達90%以上。

γT細胞高效擴增試劑盒說明書

產(chǎn)品信息

適用范圍

用于外周血或臍血體外誘導擴增γδT細胞。

有效期：十二個月

γδT細胞分離擴增步驟

樣本要求

單個核細胞存活率高于90%，新鮮外周血來源的單個核細胞總數(shù)建議控制在(20-25)×10*6個；臍血來源和凍存

的外周血來源的單個核細胞總數(shù)建議控制在(25-30)×10*6個。

γδT細胞操作步驟

1、所需主要試劑耗材

2、操作方法

2.1血液分離

血液樣本量25 mL 時， 實驗方法如下：

(1)取5支 15 mL 離心管， 各加入 5 mL PBMC分離液(與血液體積相同)。

(2)吸取血液樣本加于分離液之液面上， 800 g，離心 20 min，慢升慢降，若血液儲存超過2小時，請將離心時間增加至30 min。

(3)離心后，此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

分離圖例

2.2滅活自體血漿

(1)收集上層血漿到新的離心管中;

(2)56 ℃加熱血漿 30 min(可加8%葡萄糖酸鈣注射液混勻后共同滅活);

(3)室溫下，1200 g 離心 10 min;

(4)用移液管將上清液收集至新的離心管，4 ℃保存，直至使用前取出。

2.3制備PBMC

(1)吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一 15 mL離心管中，向所得離心管中加入 10 mL 清洗液，混勻細胞。

(2)500 xg，離心 10 min，棄上清。

(3)重復洗滌3次，棄上清。

2.4 γδT細胞擴增培養(yǎng)

(1)完全培養(yǎng)基的配制：500 μL γδT 添加劑B加入1 L基礎培養(yǎng)基中。

(2)D0：用30 mL完全培養(yǎng)基重懸PBMC，加入150 μL γδT 添加劑A ，加5%自體血漿，鋪于T75瓶中。

(3)D3: 補加30 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，加5%自體血漿，此時瓶子含60 mL培養(yǎng)基。一般情況下，培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化或細胞較多時添加。

(4)D5: 往培養(yǎng)袋補加60 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，加5%自體血漿，轉入T225培養(yǎng)瓶，此時瓶子含120 mL培養(yǎng)液。

(5)D7: 往培養(yǎng)袋補加130 mL培養(yǎng)基(含 γδT 添加劑B)，細胞濃度控制在(0.8-1.0)×106 Cell/mL，加1%自體血漿，轉入培養(yǎng)袋，此時袋子含250 mL 培養(yǎng)液，細胞轉袋前將培養(yǎng)瓶底部的細胞進行輕微吹散細胞，切勿劇烈吹打。

(6)D9: 往培養(yǎng)袋補加250 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，自體血漿按1%添加，此時袋子含500 mL培養(yǎng)液。

(7)D11: 往培養(yǎng)袋補加500 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)，此時袋子含1000 mL培養(yǎng)液。

(8)D13：往培養(yǎng)袋補加1000 mL培養(yǎng)基(含γδT 添加劑B)。推薦細胞濃度8-9天應控制在(1.0-1.5)×106 Cell/mL，第10-11天應控制在(1.5-2.0)×106 Cell/mL。

由于樣品個體差異、培養(yǎng)方式調整等因素，培養(yǎng)液體積會出現(xiàn)上下浮動，需要對γδT細胞生長狀況進行觀察分析后，進行調整。

2.5 細胞收集

(1)培養(yǎng) 14 天，擴大培養(yǎng)成功后取樣檢測細胞表型、真菌、細菌、支原體、內毒素等指標;

(2)收集培養(yǎng) 14 天后的細胞，將細胞懸浮液從培養(yǎng)袋轉入離心瓶，以 680 g 離心 10 分鐘;

(3)棄去細胞上清液，用含有 0.1%人血白蛋白的生理鹽水懸浮細胞，收集到一個離心瓶中。重復離心，清洗細胞 3 次;

(4)通過一次性細胞篩過濾，收集并注入含有 1%人血白蛋白的生理鹽水中。

注意事項

1、血液采集建議使用肝素鈉抗凝管或枸櫞酸鈉采血袋。

2、自體血漿會影響細胞的培養(yǎng)狀態(tài)，建議自體血漿預留量為30 mL左右。溶血、高脂肪可能會影響γδT細胞的擴增。

3、前7天補液時，必須將培養(yǎng)基進行室溫平衡或者水浴箱溫育培養(yǎng)基，避免低溫對細胞生長的影響。

4、如果試劑外包裝管出現(xiàn)裂縫，應立即停止使用。

5、應嚴格按照貯存要求貯存。

6、操作過程應在無菌環(huán)境下進行，必須保證操作過程中使用的所有容器及所有直接接觸細胞液的器具嚴格無菌。

7、本試劑開封后必須一次性使用完畢，不得反復凍融。

9、細胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)前7天出現(xiàn)細胞成團屬于正?，F(xiàn)象，操作過程請注意不要破壞細胞團。

10、實驗過程中產(chǎn)生的洗滌液和各種廢棄物應根據(jù)相應法規(guī)和地方監(jiān)管部門要求進行處理。