產(chǎn)品簡(jiǎn)介

B-27 Serum-Free Supplement (50×)，即 B-27 無(wú)血清添加劑(50×)，B-27 是一種最常被引用的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，是一種優(yōu)化的無(wú)血清添加劑，用于支持胚胎、出生后和成年海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和活性維持。B-27 無(wú)血清添加劑以 50 倍工作液提供，旨在與神經(jīng)基底培養(yǎng)基一起使用，神經(jīng)基底培養(yǎng)基用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)需星形膠質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層。在神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用 B-27 添加劑，用于培養(yǎng)產(chǎn)前和胚胎神經(jīng)元，以獲得優(yōu)化的活性和長(zhǎng)期的存活率。

在神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基中使用 B-27 添加劑，用于培養(yǎng)神經(jīng)來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系，可有效地保證其活性。在 DMEM/F12 培養(yǎng)基中添加 B-27 添加劑，已被證明可支持?jǐn)U增來(lái)自小鼠胚胎紋狀體和中腦的 EGF響應(yīng)性的前體細(xì)胞。

B-27 Serum-Free Supplement (50×)使用說(shuō)明

1. 完全培養(yǎng)基制備

(1)置于 4℃解凍本產(chǎn)品。

(2)在使用前無(wú)菌添加 2%本產(chǎn)品和 0.5 mM L-谷氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成神經(jīng)元完全培養(yǎng)基(注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元完全培養(yǎng)基”即指此種添加了 B-27 添加劑和 L-谷氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基)注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲(chǔ)存在-30~-5℃。在以后的試驗(yàn)中根據(jù)需要解凍相應(yīng)體積的本產(chǎn)品。避免反復(fù)凍融。

(3)對(duì)于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元完全培養(yǎng)基(由前述步驟制備)需要額外補(bǔ)充 25 μM 的L-谷氨酸，在培養(yǎng)的第 4 天以后的換液中應(yīng)不再添加谷氨酸。配置好的完全培養(yǎng)基，可于 2-8℃的避光保存一周。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元，以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中測(cè)試。

(1)用無(wú)菌的冷的 0.05 mg/mL 多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)塑料)，每平方厘米表面使用 0.15 mL，在室溫下保溫 1 h。

(2)去除多聚賴氨酸溶液，并用無(wú)菌蒸餾水沖洗兩次(須徹底清洗，因?yàn)槎嗑圪嚢彼釋?duì)細(xì)胞有毒性)。在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng)，直到每個(gè)孔都完全干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C 最多保存 2 周。

(3)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序或隨細(xì)胞提供的說(shuō)明書(shū)分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元。

(4)在預(yù)熱的(37℃)神經(jīng)元完全培養(yǎng)基中(如前所述的方法制備)接種細(xì)胞，建議的細(xì)胞密度為160 個(gè)細(xì)胞/mm 2，或必要時(shí)使用自行優(yōu)化的細(xì)胞密度。注意：對(duì)于海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)基中須添加 25μM L-谷氨酸，參見(jiàn)“完全培養(yǎng)基的制備”。

(5)在 36℃至 38℃，含 5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)(使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和 5%二氧化碳的氣體環(huán)境)。

(6)培養(yǎng) 4-24 小時(shí)后，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(7)對(duì)海馬神經(jīng)元以外的細(xì)胞：在接種 4 天后，更換一半體積的新鮮的完全培養(yǎng)基，之后每三天重復(fù)一次。對(duì)海馬神經(jīng)元：接種三天后，用不含 L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每三天重復(fù)一次。注意：在完全培養(yǎng)基中添加 25 μM2-巰基乙醇，可改善海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活率。

3. 分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元

下列程序推薦用于培養(yǎng)受精 18 天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元。

(1)從受精 18 天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬。

(2)在預(yù)置了 Hibernate-E 完全培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

(3)使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液， 只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。

(4)在不含鈣離子的 Hibernate-E 培養(yǎng)基中，使用 2 mg/mL 過(guò)濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在 30℃酶解組織大約 30 min，其間每 5 min 輕搖錐形管以幫助降解。每對(duì)海馬組織使用 2 mL 酶溶液。

(5)加入兩倍體積的 Hibernate-E 完全培養(yǎng)基以恢復(fù)二價(jià)陽(yáng)離子的濃度，停止酶解。

(6)使未解離的組織沉降至管底(約 2 min)，然后把上清液轉(zhuǎn)移到 15 mL 離心管中，以 150×g離心 5 min。

(7)在 1 mL 神經(jīng)元完全培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取一小份(例如 10 μL)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元”的第 8-10 步驟進(jìn)行。

4. 復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元

重要提示：原代神經(jīng)元細(xì)胞將會(huì)貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。由于細(xì)胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時(shí)極其脆弱，請(qǐng)?jiān)谡麄€(gè)操作過(guò)程中不要震蕩或離心細(xì)胞。我們建議每次只解凍一管細(xì)胞。務(wù)必減少?gòu)囊旱修D(zhuǎn)移凍存管到 37℃水浴中的操作時(shí)間。細(xì)胞從液氮罐到水浴的運(yùn)輸過(guò)程中，可在冰桶中放少量液氮，將細(xì)胞置于這個(gè)冰桶中來(lái)進(jìn)行。

(1)在解凍細(xì)胞之前，用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗無(wú)菌的 15 mL 錐形管，然后在超凈工作臺(tái)中通風(fēng)晾干。

(2)從液氮中取出凍存管時(shí)可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

(3)在 37℃水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細(xì)胞(小于 2 min)。當(dāng)觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時(shí)(觸摸凍存管仍然感覺(jué)是冷的)從水浴中取出。

(4)在超凈工作臺(tái)中用 70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺(tái)臺(tái)面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。

(5)使用事先用神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗并干燥過(guò)的 1 mL 吸頭極其輕柔地將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的 15 mL 錐形管中。

(6)用 1 mL 預(yù)熱的神經(jīng)元完全培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到 15 mL錐形管中的細(xì)胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動(dòng)錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。

(7)慢慢地逐滴加入另外 2 mL 預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為 4 mL。用 1 mL 吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

(8)用一個(gè)事先沖洗干燥過(guò)的吸頭吸取 10 μL 細(xì)胞懸液加入到含有 10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動(dòng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法測(cè)定活細(xì)胞密度。解凍的細(xì)胞的活率應(yīng)超過(guò) 50%。

(9)在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被(參見(jiàn)“細(xì)胞培養(yǎng)步驟”)的 48 孔板中每孔中接種大約 1×10 5個(gè)細(xì)胞或按所需的細(xì)胞密度接種。加入預(yù)熱的神經(jīng)元完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋到每孔 500 μL。

(10)按照“細(xì)胞培養(yǎng)步驟”中的 5-6 步驟進(jìn)行神經(jīng)元的培養(yǎng)。在 36℃至 38℃，含 5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)(使用自然空氣也是可接受的，但推薦含 9%氧氣和 5%二氧化碳的氣體環(huán)境)。

B-27 Serum-Free Supplement (50×)注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品經(jīng)過(guò)嚴(yán)格除菌過(guò)濾，為無(wú)菌產(chǎn)品，必須在超凈臺(tái)內(nèi)使用，以避免微生物污染。

2.本產(chǎn)品須盡量避免光照。本產(chǎn)品充分融解并混勻后，如有必要，可以適當(dāng)分裝后-20℃避光保存。短期內(nèi)如果頻繁使用，可以 4℃避光保存，并建議在 1-2 周內(nèi)用完。

3.本產(chǎn)品長(zhǎng)時(shí)間存放可能會(huì)出現(xiàn)少量沉淀，可上下顛倒混勻，完全溶解后即可正常使用。

4.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

5.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。