背景簡(jiǎn)介

Puromycin是來(lái)源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、病毒感染等方法能表達(dá)pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。本產(chǎn)品的10mg/mL包裝經(jīng)過(guò)濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。在革蘭氏陽(yáng)性菌、動(dòng)物或昆蟲(chóng)細(xì)胞中，嘌呤霉素通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成而抑制或殺死細(xì)胞。其作用機(jī)制為嘌呤霉素是氨酰-tRNA 分子3’末端的類似物，能夠與核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素與A位點(diǎn)結(jié)合后，不會(huì)參與隨后的任何反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。Pac基因表達(dá)嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，該基因是在Streptomyces alboniger 中發(fā)現(xiàn)的。如果表達(dá)基因，就會(huì)對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株等。例如，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，從而利用嘌呤霉素篩選特定基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。嘌呤霉素也可以用來(lái)篩選表達(dá)pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。

產(chǎn)品參數(shù)

化學(xué)性質(zhì)

Puromycin Dihydrochloride 嘌呤霉素使用方法

1.推薦工作濃度：推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/mL，但最佳工作濃度需要通過(guò)劑量反應(yīng)曲線來(lái)確定。

部分常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的推薦工作濃度表

2. 嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例)

嘌呤霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素非常重要。對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)。

a. 第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細(xì)胞，接種夠量的孔以便進(jìn)行后續(xù)的劑量梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。

b. 第二天：在培養(yǎng)過(guò)夜后的細(xì)胞中更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，該篩選培養(yǎng)基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/mL等)，更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

c. 第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在加嘌呤霉素后的1-2天就可以進(jìn)行觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最低濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日觀察，一般4-10天內(nèi)即可確定嘌呤霉素的最低濃度。

3. 哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選

轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)?；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞?，即可篩選穩(wěn)定表達(dá)株。

a. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。

注意：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過(guò)25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過(guò)密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后即可進(jìn)行嘌呤霉素篩選。

b. 每隔2-3天，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

c. 篩選7天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。

注意：每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時(shí)，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。

d. 待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。

注意事項(xiàng)

1.本產(chǎn)品對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

2.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

3.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。