產(chǎn)品簡(jiǎn)介

聚凝胺(Polybrene)也稱(chēng)海美溴銨(hexadimethrine bromide)是一類(lèi)高價(jià)離子季銨鹽多聚物，溶解后帶正電，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，能顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，一般能是高感染效率2~10倍。Polybrene目前廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒及慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，是一種常用的促感染試劑，能顯著提高病毒與細(xì)胞的接觸及感染效率，其作用機(jī)理可能是通過(guò)中和細(xì)胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進(jìn)吸附作用。同時(shí)，polybrene也常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以增強(qiáng)脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，但Polybrene對(duì)某些細(xì)胞也是存在毒性的，因此，使用之前要先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試。

Polybrene也是一種有名的抗肝素劑(肝素拮抗劑)，常用來(lái)生產(chǎn)非特異性凝集的紅細(xì)胞。它還參與到低分子量DNA的轉(zhuǎn)化中。此外，Polybrene也多用于蛋白測(cè)序，因?yàn)樾┝康腜olybrene在自動(dòng)測(cè)序分析可明顯改善多肽的降解現(xiàn)象。PVDF膜加入polybrene還能提高膜的親和性，降低測(cè)序過(guò)程中多肽的機(jī)械損傷。 本產(chǎn)品以溶液形式提供，粉末用0.9%NaCl配制成10 mg/mL的溶液，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。使用時(shí)一般按1:1000-1:5000稀釋?zhuān)兰?xì)胞種類(lèi)不同稀釋比例不同，具體使用濃度請(qǐng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)或者預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索。

產(chǎn)品參數(shù)

Polybrene (聚凝胺)使用說(shuō)明

一、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(Retroviral Infection)

1. 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒原液的制備：取5 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基(5%血清)加入含單層轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄包裝細(xì)胞的100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45 μm濾器過(guò)濾。

2. 待感染細(xì)胞的培養(yǎng)：100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL培養(yǎng)基，細(xì)胞密度為5x105/皿。

3. 病毒感染：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)液。用含polybrene的2 mL病毒上清(或?qū)⒉《驹合♂尩? mL)感染細(xì)胞，polybrene的終濃度為5-10 μg/ml。37℃ 孵育3-6h。

4. 收集病毒顆粒：加入8 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)2-3天后，收集培養(yǎng)基上清，處理得到病毒顆粒。

二、轉(zhuǎn)染

1. 完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞密度約50%;

2. 孵育細(xì)胞18-24h后準(zhǔn)備DNA-培養(yǎng)基-Polybrene混合液，按如下操作制備混合液：

①添加完全培養(yǎng)基(60 mm培養(yǎng)皿2 mL，100 mm培養(yǎng)3 mL)37℃預(yù)熱;

②添加10 ng~10 ug質(zhì)粒輕輕混勻;

③加入Polybrene至終濃度為5-10 μg/mL。輕輕混勻。以上每個(gè)成分需要按順序加入。

3.去除培養(yǎng)基，在細(xì)胞中加入DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液，在37℃ 孵育細(xì)胞6-20h。細(xì)胞培養(yǎng)的前6h內(nèi)約每1.5h輕柔混勻。

4.去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shock solution (15%DMSO in 1X HBSS )輕輕蓋住細(xì)胞(60 mm培養(yǎng)皿3 mL，100 mm培養(yǎng)皿4 mL)。每次加入溶液時(shí)用手輕晃培養(yǎng)皿10s，使得液體均勻分布。然后37℃ 孵育細(xì)胞4min。

5.立即去除DMSO shock solution，用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞2次。對(duì)于60 mm培養(yǎng)皿每次用5 mL培養(yǎng)液清洗，100 mm培養(yǎng)皿每次用10 mL培養(yǎng)液清洗。

6.加入完全培養(yǎng)基到細(xì)胞中。

7.蛋白表達(dá)：培養(yǎng)24-72 h后，根據(jù)需要收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)情況檢測(cè)。

細(xì)胞篩選：培養(yǎng)24-72 h后，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，換新鮮的選擇培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞篩選。

使用注意事項(xiàng)

1.為避免反復(fù)凍融，收到本產(chǎn)品或本產(chǎn)品配制成溶液后建議適當(dāng)分裝后-20℃保存。

2.因?yàn)镻olybrene對(duì)某些細(xì)胞可能有一定的毒性，而且Polybrene長(zhǎng)時(shí)間作用(大于12小時(shí))也可能對(duì)某些細(xì)胞產(chǎn)生毒性，所以初次使用Polybrene處理細(xì)胞，建議先做毒性測(cè)試。

3.本產(chǎn)品可能對(duì)人體有一定的毒害作用，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)，以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5.本產(chǎn)品僅供科研實(shí)驗(yàn)用，不做其它用途