產(chǎn)品簡(jiǎn)介

G-418(Geneticin，遺傳霉素)是一種結(jié)構(gòu)類似于慶大霉素B1的氨基糖苷類抗生素，在分子遺傳試驗(yàn)中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。G-418可以干擾80S核糖體的功能，并影響真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，主要用于哺乳動(dòng)物、植物或酵母細(xì)胞的選擇。G-418 對(duì)細(xì)菌、酵母、高等植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、原蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)均有毒性，其抗性基因?yàn)轱@性表型，在Tn601(903)和Tn5轉(zhuǎn)座子上都有定位。雖然這個(gè)基因來(lái)源于細(xì)菌，但也可以在真核細(xì)胞中表達(dá)。將抗性基因引入細(xì)胞可引起對(duì)G-418的抗性，使細(xì)胞能夠在含有G-418的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。G418的這一選擇特性，已廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面。

植物細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括 G418，卡那霉素和巴龍霉素。

G418與新霉素同為氨基糖苷類抗生素，都可被Neo基因產(chǎn)物失活，因此都可以用于篩選攜帶Neo抗性基因的細(xì)胞，新霉素篩選的細(xì)胞都可以用G418替代。

產(chǎn)品信息

G418遺傳霉素使用說(shuō)明

一、建議使用濃度

一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉(zhuǎn)化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418維持培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件，細(xì)胞類型和其它的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)劑量反應(yīng)性曲線(dose-response curve or kill curve)，來(lái)確定最佳篩選濃度。通常情況，哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選范圍200-2000μg/mL;植物細(xì)胞：10-100μg/mL;酵母細(xì)胞：500-1000μg/mL。

表1.部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞的推薦工作濃度表

二、遺傳霉素劑量反應(yīng)曲線的建立

遺傳霉素的有效篩選濃度跟細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株，確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的遺傳霉素最低濃度非常重要，對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)，曲線建立時(shí)至少應(yīng)設(shè)置6個(gè)遺傳霉素濃度。遺傳霉素處理分裂期的細(xì)胞時(shí)活性最強(qiáng)，因此在添加遺傳霉素之前需要先將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間。

a.第一天：未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞按照20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過(guò)夜。

注：對(duì)于需要更高密度來(lái)檢測(cè)活力的細(xì)胞，可增加接種量。

b.根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定0、50、100、200、400、800、1000μg/mL。

c.第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度遺傳霉素的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

d.接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。

e.按照固定的周期(如每2天)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想的天數(shù)(通常是7-10天)內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選用的工作濃度。

3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

a.細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度遺傳霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。

b.注：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。當(dāng)細(xì)胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過(guò)25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過(guò)密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后即可進(jìn)行遺傳霉素篩選。每隔3-4天更換含有遺傳霉素的培養(yǎng)液。

c.篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆(集落)的形成情況。對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)neo基因的細(xì)胞。根據(jù)宿主細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染/篩選效率不同，集落的形成可能需要一周或者更多的時(shí)間。

d.克隆形成后，挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

e.之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

G418遺傳霉素使用注意事項(xiàng)

1. G418不要和其它抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用，因?yàn)樗鼈兪荊418的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。其它的抗生素也會(huì)產(chǎn)生交叉活性。

2. G418加入培養(yǎng)體系中，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有可能不會(huì)被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細(xì)胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細(xì)胞相對(duì)于緩慢增殖細(xì)胞，更容易被殺死。對(duì)照細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染)可能在添加抗生素5-7天后才能被殺死，轉(zhuǎn)染細(xì)胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。

3. 即使加入有效劑量的G418，細(xì)胞可能會(huì)繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

4. 本產(chǎn)品可能對(duì)人體有一定的毒害作用，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)，以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

5. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅用于科研用途，不可用于診斷、治療、臨床、家庭及其他用途。