產(chǎn)品描述

本產(chǎn)品為人多能干細(xì)胞向神經(jīng)干/祖細(xì)胞(iNSPC)誘導(dǎo)分化試劑盒，分化獲得的NSPC能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物(如SOX2、SOX1、Nestin 等)，適用于體外研究。

本產(chǎn)品需要操作人員具有細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)多能干細(xì)胞2D誘導(dǎo)分化以及神經(jīng)球培養(yǎng)具有一定了解。

以六孔板為例，本產(chǎn)品提供的規(guī)格可供16孔的hPSC誘導(dǎo)分化。

本產(chǎn)品分化流程圖

產(chǎn)品信息

表1. 試劑盒組成信息

注：括號(hào)內(nèi)容如50×為母液濃度，使用時(shí)終濃度需為1×。例如補(bǔ)充劑A(50×)和補(bǔ)充劑B (100×)需添加進(jìn)NSPC誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基使其分別稀釋50倍以及100倍，使得補(bǔ)充劑終濃度為1×，配成NSPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基。NSPC誘導(dǎo)包被液濃度500 U/mL表示每毫升有500個(gè)單位的包被蛋白。

實(shí)驗(yàn)試劑與材料

表2. 推薦試劑&材料

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(以hESC H1及6孔板1個(gè)孔為例)

一、試劑準(zhǔn)備

表3. 各階段培養(yǎng)基成分

(1) 在 4℃解凍 補(bǔ)充劑 A、B、C，不要在 37℃條件下解凍。

(2) 在生物安全柜中，參考表1及表 3，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養(yǎng)基 。例如NSPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為NSPC誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1×濃度的補(bǔ)充劑A和1×濃度的補(bǔ)充劑B，若用量為50 mL，配制方法為48.5mL NSPC誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1 mL補(bǔ)充劑A(50×)+500μL補(bǔ)充劑C(100×)。

(3) 分化培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，置于 4℃儲(chǔ)存，2 周內(nèi)使用。

注：補(bǔ)充劑可根據(jù)使用量進(jìn)行分裝以避免反復(fù)凍融。

三、DAY 0-6: hESC分化為神經(jīng)干/祖細(xì)胞(NSPC)

(1) NSPC誘導(dǎo)包被液在4℃下解凍，與DMEM/F12均勻混合，稀釋成合適的濃度，按2 U/cm²的包被密度鋪板，備用。

(2) DAY 0：當(dāng)hESC的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS(不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。

(4) 3-5min后，將干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(5) 從步驟(1)包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。

(6) 離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的NSPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分為：NSPC誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑A，1×補(bǔ)充劑B)(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(7) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將細(xì)胞接種到步驟1制備的包被板上使得最終密度為6.0 -8.0× 10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²，在6孔板中每孔最終體積為2 mL(含10μM Y-27632)，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。

(8) DAY 2：48h后吸去培養(yǎng)基，并加入不含2mL Y-27632的NSPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔天換液直到第7天。

(9) 可取第7天的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測NSPC標(biāo)志物如SOX2、SOX1、Nestin。

注：包被液使用時(shí)需在冰上操作，所有與包被液直接接觸的物品需提前預(yù)冷。

四、NSPC維持培養(yǎng)階段

(1) DAY 7：第7天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。

(3) 3-5min后，將DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(4) 離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基(成分為：NSPC擴(kuò)增基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑C)(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(5) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，使用NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，將細(xì)胞以5×10⁵/mL接種到低吸附六孔板中，在6孔板中每孔最終體積為2 mL(含10μM Y-27632)，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。

(6) 24h后，100g離心棄去上清，換成不含Y-27632的NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基，視培養(yǎng)基顏色或隔2天半量換液。

(7) 當(dāng)NSPC長成100-150μm直徑的神經(jīng)球時(shí)，建議進(jìn)行傳代。

注：①當(dāng)形成肉眼可見的神經(jīng)球時(shí)，可將神經(jīng)球搖晃至中心，緩慢傾斜一定角度，沿著液面緩慢棄去培養(yǎng)基，在不吸到神經(jīng)球的情況下盡量將培養(yǎng)基吸盡，進(jìn)行換液，盡量避免離心。②NSPC可使用逸漠生物神經(jīng)細(xì)胞無血清凍存液在液氮中冷凍。

五、NSPC傳代

(1) 將神經(jīng)球搖晃至中心，吸取中間神經(jīng)球于15mL離心管，100g 離心5 min。

(2) 棄去上清后加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，將離心管置于37℃水浴消化10-15 min。

(3) 10-15 min后每孔加入1mL NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基(含10μM Y-27632)，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞解離成小團(tuán)塊或單細(xì)胞。

(4) 將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(5) 仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用1mL恢復(fù)室溫的NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保細(xì)胞溶液均勻。

(6) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，使用NSPC擴(kuò)增培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，將細(xì)胞以5×10⁵/mL接種到低吸附六孔板中。

注：僅分化結(jié)束收獲細(xì)胞時(shí)第一天必須添加10 μM Y-27632，后續(xù)傳代第一天不需要添加10 μM Y-27632。