產(chǎn)品描述

本產(chǎn)品為人多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化試劑盒，分化獲得的心肌細(xì)胞具有搏動(dòng)能力，能表達(dá)特異性標(biāo)志物(如 Cardiac Troponin T 等)，適用于體外研究。

本產(chǎn)品需要操作人員具有細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)心肌細(xì)胞具有一定了解。

以六孔板為例，本產(chǎn)品提供的規(guī)格可供6個(gè)孔的hPSC(約3×10⁶ 個(gè)細(xì)胞)誘導(dǎo)分化。

本產(chǎn)品分化流程圖

hPSC：人多能干細(xì)胞;CM：心肌細(xì)胞

產(chǎn)品信息

表1. 試劑盒組成信息

注：括號(hào)內(nèi)容如50×為母液濃度，使用時(shí)終濃度需為1×。例如補(bǔ)充劑A(50×)和補(bǔ)充劑B (25×)需添加進(jìn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基使其分別稀釋50倍以及25倍，使得補(bǔ)充劑終濃度為1×，配成心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基1。

實(shí)驗(yàn)試劑與材料

表2. 推薦試劑&材料

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(以hESC H1及6孔板1個(gè)孔為例)

一、試劑準(zhǔn)備

表3. 各階段培養(yǎng)基成分

(1) 在 4℃解凍補(bǔ)充劑 A、B、C、D，不要在 37℃條件下解凍。

(2) 在生物安全柜中，參考表1及表 3，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養(yǎng)基 。例如心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基1組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1×濃度的補(bǔ)充劑A和1×濃度的補(bǔ)充劑B，若用量為12 mL，配制方法為11.28 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基+240μL補(bǔ)充劑A(50×)+480μL補(bǔ)充劑B(25×)。

(3) 分化培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，置于 4℃儲(chǔ)存，2 周內(nèi)使用。

注：所有補(bǔ)充劑以及心肌細(xì)胞消化液可根據(jù)使用量進(jìn)行分裝以避免反復(fù)凍融。

三、DAY 0-2: hESC向中胚層誘導(dǎo)

(1) DAY -1： 當(dāng)hESC的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1×室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。

(3) 3-5min后，將干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液收集到15mL離心管中，室溫下200 g離心5 min。

(4) 離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(5) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，按2.5 × 10⁵個(gè)細(xì)胞/mL，接種于低吸附6孔板中每孔最終體積為2 mL(含10μM Y-27632)，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。

(6) DAY 0：24 h后，在鏡下觀察，細(xì)胞球直接應(yīng)在50μm-100μm左右。100g離心3min，吸去培養(yǎng)基，加入2mL心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基1(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑A，1×補(bǔ)充劑B)重懸，轉(zhuǎn)移至原孔內(nèi)。

(7) DAY 1：使用心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基2(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑A)，按步驟(6)操作換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

注：細(xì)胞球直徑盡量控制在50μm-100μm附近，若過大，在分化后期將導(dǎo)致細(xì)胞球死亡解聚。換液時(shí)盡量不要過多吹打細(xì)胞球，除低速離心外，還可將細(xì)胞球吸至15mL離心管，待其自然沉降，棄上清換液。除了用低吸附板外，還可使用經(jīng)過防止細(xì)胞貼壁的特殊液體潤洗的板進(jìn)行培養(yǎng)。

四、DAY 2-7: 中胚層向心肌中胚層誘導(dǎo)

(1) DAY 2： 將細(xì)胞球搖晃至中心，緩慢傾斜一定角度，沿著液面緩慢棄去培養(yǎng)基，在不吸到細(xì)胞球的情況下盡量將培養(yǎng)基吸盡。每孔加入2 mL 心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基3(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑A，1×補(bǔ)充劑C)，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

(2) DAY 4：將細(xì)胞球搖晃至中心，緩慢傾斜一定角度，沿著液面緩慢棄去培養(yǎng)基，在不吸到細(xì)胞球的情況下盡量將培養(yǎng)基吸盡。每孔加入2 mL 心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基2(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑A)，隔天換液，直到DAY 7 。

注：除步驟中換液方式外，還可將細(xì)胞球吸至15mL離心管，待其自然沉降，棄上清換液，換液時(shí)盡量不要吹打細(xì)胞球。

五、DAY 7-15: 心肌中胚層向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)

(1) DAY 7: 將細(xì)胞球搖晃至中心，緩慢傾斜一定角度，沿著液面緩慢棄去培養(yǎng)基，在不吸到細(xì)胞球的情況下盡量將培養(yǎng)基吸盡。每孔加入2 mL 心肌成熟培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1×補(bǔ)充劑D)，隔天換液，直到DAY 15 。

(2) DAY 15: 將細(xì)胞球搖晃至中心，緩慢傾斜一定角度，沿著液面緩慢棄去培養(yǎng)基，在不吸到細(xì)胞球的情況下盡量將培養(yǎng)基吸盡。每孔加入2 mL 心肌細(xì)胞消化液，于培養(yǎng)箱中孵育3-4 h。待單個(gè)細(xì)胞顆粒明顯時(shí)，隨后使用同等體積的心肌成熟培養(yǎng)基(含10μM Y-27632)中止消化，吹散。

(3) 200 g離心棄去上清，可加入心肌成熟培養(yǎng)基重懸接種于Matrigel上進(jìn)行維持培養(yǎng)，或加入凍存液進(jìn)行凍存。

注：1、在第8天至第15天之間，可觀察到搏動(dòng)的細(xì)胞。

       2、消化時(shí)可將六孔的細(xì)胞球收集至2孔或3孔進(jìn)行消化。凍存液可以使用90%FBS+10%DMSO或心肌細(xì)胞凍存液(逸漠生物，IMC-705)進(jìn)行凍存。

       3、若進(jìn)行2D維持培養(yǎng)，消化時(shí)可使用心肌細(xì)胞消化液消化1-2 h。

       4、進(jìn)行2D培養(yǎng)時(shí)，若雜細(xì)胞較多，可加入心肌純化培養(yǎng)基進(jìn)行純化。觀察純化情況，最長可純化4天，期間換一次液