產(chǎn)品描述

本產(chǎn)品為人多能干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元誘導(dǎo)分化試劑盒，可用于分化獲得的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元能表達(dá)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物(如 CHAT 等)，適用于體外研究。

本產(chǎn)品需要操作人員具有細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)神經(jīng)元培養(yǎng)具有一定了解。

以六孔板為例，本產(chǎn)品提供的規(guī)格可供兩個(gè)孔的hPSC誘導(dǎo)分化，最終可獲得6個(gè)孔的成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(約1.2×10⁷個(gè)細(xì)胞)，以及可供運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞擴(kuò)增一代(六孔板1孔傳6孔)。

本產(chǎn)品分化流程圖

hPSC：人多能干細(xì)胞;NPC：神經(jīng)祖細(xì)胞;MNP：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞;MN：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元;mMN：成熟運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元

產(chǎn)品信息

表1. 試劑盒組成信息

注：括號(hào)內(nèi)容如250×為母液濃度，使用時(shí)終濃度需為1×。例如補(bǔ)充劑A(250×)和補(bǔ)充劑C (62.5×)需添加進(jìn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基1使其分別稀釋250倍以及62.5倍，使得補(bǔ)充劑終濃度為1×，配成NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)試劑與材料

表2. 推薦試劑&材料

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法(以hESC H1及6孔板1個(gè)孔為例)

一、試劑準(zhǔn)備

表3. 各階段培養(yǎng)基成分

(1) 在 4℃解凍 補(bǔ)充劑 A、B、C、D、E、F，不要在 37℃條件下解凍。

(2) 在生物安全柜中，參考表1及表 3，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養(yǎng)基 。例如NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基1、1×濃度的補(bǔ)充劑A和1×濃度的補(bǔ)充劑C，若用量為20mL，配制方法為19600μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+80μL補(bǔ)充劑A(250×)+320μL補(bǔ)充劑C(62.5×)。

(3) 分化培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，置于 4℃儲(chǔ)存，2 周內(nèi)使用。

注：補(bǔ)充劑B、D、F使用時(shí)盡量避光，且所有補(bǔ)充劑可根據(jù)使用量進(jìn)行分裝以避免反復(fù)凍融。

三、DAY 0-6: hESC分化為神經(jīng)祖細(xì)胞(NPC)

(1) 基質(zhì)膠在4℃下解凍，與DMEM/F12均勻混合(基質(zhì)膠:DMEM/F12=1:100)，鋪板，備用。

(2) DAY -1: 當(dāng)hESC的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗hESC，吸去PBS。

(3) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。

(4) 3-5min后，將干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(5) 從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面。

(6) 離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(7) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將細(xì)胞接種到步驟1制備的6孔基質(zhì)膠包被的板上使得最終密度為3.0 × 10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²，在6孔板中每孔最終體積為2 mL(含10μM Y-27632)，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。

(8) DAY 0: 24h后吸去培養(yǎng)基，并加入2mL NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1，1×補(bǔ)充劑A，1×補(bǔ)充劑C)。

(9) 隔天使用NPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基換液，直到第6天。

(10) 可取第6天的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測NPC標(biāo)志物如SOX2、SOX1、Nestin。

注：基質(zhì)膠使用時(shí)需在冰上操作，所有與基質(zhì)膠直接接觸的物品需提前預(yù)冷，基質(zhì)膠超過10℃將迅速凝固，導(dǎo)致鋪板失敗。

四、DAY 6-12: NPC誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞(MNP)

(1) DAY 6： 第6天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL 1×室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS。

(2) 加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細(xì)胞。

(3) 3-5min后，將DMEM/F12(含10μM Y-27632)以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(4) 從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面。

(5) 離心結(jié)束，充分去除上清，將6 mL預(yù)熱的MNP誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1，1×補(bǔ)充劑B，1×補(bǔ)充劑C)(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。按1:3比例接種在基質(zhì)膠包被的板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液于37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 。

(6) DAY 7: 第7天開始隔天更換一次MNP誘導(dǎo)培養(yǎng)基，直到第12天。

(7) 可取第12天的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色檢測MNP標(biāo)志物Olig2。

注：MNP可用常規(guī)冷凍培養(yǎng)基(DMEM/F12、10%胎牛血清和10% DMSO)或逸漠生物無血清細(xì)胞凍存液(推薦使用)在液氮中冷凍，解凍后可在MNP擴(kuò)增培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，培養(yǎng)方法見補(bǔ)充部分。

五、DAY 12-18: MNP誘導(dǎo)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MN)

(1) DAY 12: 第12天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1×室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，吸去PBS。

(2) 每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，將培養(yǎng)物置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底。

(4) 將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(5) 仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用1mL恢復(fù)室溫的MN誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基2，1×補(bǔ)充劑D，1×補(bǔ)充劑E)(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(6) 使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將細(xì)胞接種到提前制備的基質(zhì)膠包被的6孔板上使得密度為5.0 ×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²。

(7) DAY 13: 更換為不含Y-27632的MN誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每隔一天更換培養(yǎng)基，直到第18天。

(8) 第18天可檢測到神經(jīng)元標(biāo)志物(TuJ1)， 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)志物(PHOX2B 、PRPH、ISL1、ISL2)的表達(dá)

注：Motor Neuron 貼壁較松，換液時(shí)要特別輕柔。

六、DAY 18-28: MN成熟階段

(1) DAY 18: 第18天，吸去培養(yǎng)基，每孔加入2mL MN成熟培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基2，1×補(bǔ)充劑E)。

(2) 隔天換液，直到第28天獲得成熟MN(mMN)。

(3) mMN可用MN成熟培養(yǎng)基繼續(xù)維持培養(yǎng)。

(4) 這一階段可檢測到CHAT的表達(dá)。

注：Motor Neuron 貼壁較松，換液時(shí)要特別輕柔。

補(bǔ)充:DAY 12: MNP擴(kuò)增

第12天獲得的MNP可擴(kuò)增至少5代，5代內(nèi)可維持Olig2高表達(dá)。

擴(kuò)增方法如下：

(1)DAY 12: 第12天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1×室溫PBS(不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，吸去PBS。

(2)每孔加入1mL含Y-27632(10 μM)的室溫Accutase，將培養(yǎng)物置于37℃ 5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3-5 min。

(3) 3-5min后每孔加入1mL DMEM/F12(含10μM Y-27632)，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底。

(4)將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。

(5)仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用1mL恢復(fù)室溫的MNP擴(kuò)增培養(yǎng)基(成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1，1×補(bǔ)充劑C，1×補(bǔ)充劑F)(含10μM Y-27632)重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。

(6)按1:6比例接種在基質(zhì)膠包被的板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液于37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 。

(7)第2天更換不含Y-27632的MNP擴(kuò)增培養(yǎng)基。每周可傳一次代。