產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品為iPSC誘導(dǎo)分化肺類器官試劑盒，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞hiPSC通過(guò)該試劑盒誘導(dǎo)分化可得到肺類器官，該類器官由類似肺泡的細(xì)胞組成，成熟后的類器官有氣道細(xì)胞、肺泡細(xì)胞。
本試劑盒需要操作人員具有hiPSC培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進(jìn)一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導(dǎo)分化肺類器官試劑盒

實(shí)驗(yàn)儀器、材料

儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、低溫冰箱
材料：細(xì)胞培養(yǎng)板（規(guī)格為：6孔、12孔、24孔）、離心管（規(guī)格為15 mL 和 50 mL）、移液器（規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL）、無(wú)菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（規(guī)格為10 mL、50 mL）

操作步驟

一、hiPSC分化為內(nèi)胚層細(xì)胞（DE）（按6孔板1孔算）
（1）基質(zhì)膠在4℃下解凍，與DMEM/F12均勻混合，鋪板，備用。
（2）當(dāng)hiPSC的匯合度達(dá)到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hiPSC，吸去PBS。
（3）加入1 mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中20 min，使其解離成單細(xì)胞。
（4）20 min后，將干細(xì)胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（5）從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面。
（6）離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的干細(xì)胞培養(yǎng)基（含10 μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將密度為2.0 *105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞接種到步驟1制備的6孔基質(zhì)膠包被的板上，在6孔板中每孔最終體積為2 mL，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。
（8）24h后（第1天）吸去培養(yǎng)基，并加入1.97 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+10 μL補(bǔ)充劑A+20μL補(bǔ)充劑B。
（9）在第2天和第3天，吸去培養(yǎng)基，加入1.98 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+20 μL補(bǔ)充劑B，開始分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。
二、DE誘導(dǎo)分化為前腸內(nèi)胚層細(xì)胞(AFE)
（1）第4天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS，每孔加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基2。
 （2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3天。
三、AFE誘導(dǎo)分化為肺祖細(xì)胞(LPC)（以12孔板4個(gè)孔為例）
（1）29.92 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基3+80 μL補(bǔ)充劑C配成LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
（2）第7天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，吸去PBS。
 （3）每孔加入1 mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase，將培養(yǎng)物置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10 min。
 （4）10 min后每孔加入1 mL DMEM/F12（含10μM Y-27632），輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底。
 （5）將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（6）仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用1 mL恢復(fù)室溫的LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將密度為2.0 x105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞接種到提前制備的12孔基質(zhì)膠包被的板上，在12孔板中每孔培養(yǎng)基最終體積為1 mL。
（8）第二天，更換為不含Y-27632的LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)11天。
四、LPC誘導(dǎo)分化為3D肺類器官（以24孔板6個(gè)孔為例）
（1）第18天，14.965 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基4+35 μL補(bǔ)充劑D配制成3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
（2）在冰上解凍基質(zhì)膠，并將移液器吸頭提前置于-20℃冰箱中。
（4）吸出LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用1 mL1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)洗滌1次。
（3）加入含10 μM Y-27632的室溫Accutase（0.5 mL/12孔）并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min； 10 min后每孔加入1 mL恢復(fù)室溫的DMEM/F12（含10 μM Y-27632），輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底。
（5）將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（6）仔細(xì)抽吸上清液，不干擾細(xì)胞，用1 mL 3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻。 （7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞。
注意：每個(gè)細(xì)胞系必須優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量；在分化的18天內(nèi)，細(xì)胞不應(yīng)變得過(guò)度融合。
（8）室溫下以300 g離心5min，吸出培養(yǎng)基并將細(xì)胞重懸于冷基質(zhì)膠中，對(duì)于ESC，每孔4.0*104個(gè)細(xì)胞添加200 μL基 質(zhì)膠，對(duì)于iPSC，每孔 8.0*104個(gè)細(xì)胞，添加200 μL基質(zhì)膠，將基質(zhì)膠與細(xì)胞一起置于冰上。
（9）將200 μL基質(zhì)膠/細(xì)胞混合物按每孔30 μL接種到24孔板中。
（10）將板置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中20-30分鐘使基質(zhì)膠凝固。
（11）每孔加入700 μL 3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)6天。
（12）在第23天，14.96 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基5+40 μL補(bǔ)充劑E配制成3D類器官分化培養(yǎng)基，將孔里的培養(yǎng)基更換為700 μL恢復(fù)室溫的3D類器官分化培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基，持續(xù)6天。
（13）在第29天，199.48 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基6+520 μL補(bǔ)充劑F配制成3D類器官成熟培養(yǎng)基，將孔里的培養(yǎng)基更換為700 μL恢復(fù)室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基，進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。
五、3D肺類器官傳代
（1）取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預(yù)冷1h；
（2）吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的Tryple（ 含1%BSA ），靜置1min；
（3）使用1 mL移液槍，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要產(chǎn)生氣泡；
（4）每孔加入1 mL預(yù)冷的PBS（ 含1%BSA ），將混合物轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中；
（5）用1 mL預(yù)冷的PBS（ 含1%BSA ）清洗培養(yǎng)板，并將該清洗液加入上一步的離心管中，并補(bǔ)充預(yù)冷的PBS（含1%BSA），使離心管中的終體積為12 mL；300 g離心5min，去上清；
（6）用預(yù)冷槍頭按每孔30 μL的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8次，均勻混合單細(xì)胞-基質(zhì)膠，注意吹打過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡；
（7）將提前放在培養(yǎng)箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30 μL膠滴，緩慢打入混合液時(shí)，逐漸向上移動(dòng)槍頭，使細(xì) 胞均勻分布在膠中；
（8）將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固；
（9）小心沿孔壁加入700 μL恢復(fù)室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基，每隔1天換液一次（可周一、周三、周五換液，周五可添加至800 μL，周六、周日不換液），注意不要碰到膠滴，將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。

流程圖及參考圖片