產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品為iPSC誘導分化肝類器官試劑盒，人誘導多能干細胞hiPSC通過該試劑盒誘導分化可得到肝類器官，該類器官由肝細胞組成囊泡狀結(jié)構(gòu)，成熟后的類器官具有肝干細胞和肝祖細胞的雙表型特征。
本試劑盒需要操作人員具有hiPSC培養(yǎng)經(jīng)驗，對類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導分化肝類器官試劑盒

實驗儀器、材料

儀器：生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱
材料：細胞培養(yǎng)板（ 規(guī)格為：6孔、12孔、24孔 ）、離心管（ 規(guī)格為15 mL 和 50 mL ）、移液器（ 規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL ）、無菌吸頭（ 規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL ）、移液管（ 規(guī)格為10mL、50mL ）

操作步驟

一、hiPSC分化為內(nèi)胚層細胞（DE）（按6孔板1孔算）
（1）1.93 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+20 μL補充劑A+50 μL補充劑B配成DE分化培養(yǎng)基1；
（2）基質(zhì)膠在4℃下解凍，與DMEM/F12均勻混合，鋪板，備用。
（3）當hiPSC的匯合度達到75%-85%，吸去培養(yǎng)基,用2 mL 1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hiPSC，吸去PBS。
（4）加入1 mL的室溫EDTA（含10 μM Y-27632），轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中5 min，使其解離成單細胞。
（5）5 min后，吸去EDTA，加入等體積的干細胞傳代培養(yǎng)基（含10 μM Y-27632），并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞。將細胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（5）從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面。
（6）離心結(jié)束，充分去除上清，用1 mL DE分化培養(yǎng)基1 重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（7）將細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被的孔中，加入1mL DE分化培養(yǎng)基1 ，使孔中的體積達到2 mL；
（8）24h后（第1天），3.96mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+40 μL補充劑A配成DE分化培養(yǎng)基2 ，吸去培養(yǎng)基，并加入2 mL DE分化培養(yǎng)基2 ，連續(xù)培養(yǎng)2天。
二、DE誘導分化為肝特化譜系細胞(HS)
（1）第3天，14.925 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基2+75 μL補充劑C配制成HS培養(yǎng)基，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除PBS，每孔加入2 mL HS培養(yǎng)基。
（2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)5天。
三、HS誘導分化為3D肝類器官（以24孔板6個孔為例）
（1）第8天，199.48 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基3+520 μL補充劑D配制成3D肝類器官培養(yǎng)基
（2）在冰上解凍基質(zhì)膠，并將移液器吸頭提前置于-20℃冰箱中。
（3）吸出HS培養(yǎng)基，用2 mL1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)洗滌1次。
（4）加入含10 μM Y-27632的室溫EDTA并在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min；5 min后吸去EDTA，每孔加入1 mL恢復室溫的DMEM/F12（含10 μM Y-27632），輕輕吹打細胞，使細胞脫離孔底。
（5）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞。
（6）將細胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g 離心5 min，吸出培養(yǎng)基并將細胞重懸于冷基質(zhì)膠中，以3000-10000個細胞/孔的密度包埋在30-50μL基質(zhì)膠中，將基質(zhì)膠與細胞一起置于冰上。
（7）將200 μL基質(zhì)膠/細胞混合物按每孔30 μL接種到24孔板中。
（8）將板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中20-30分鐘使基質(zhì)膠凝固。
（9）每孔加入700 μL 3D肝類器官培養(yǎng)基進行長期培養(yǎng)，每隔一天更換培養(yǎng)基，7-10天傳代。
四、3D肝類器官傳代
（1）取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預冷1h；
（2）吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預冷的PBS溶解基質(zhì)膠，將混合液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，300g 離心5min，去除上層的PBS和基質(zhì)膠；
（3）加入1 mL Tryple（含1% BSA），吹打5-8次，使類器官與Tryple充分接觸，接著轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，靜置解離5min；
（4）5min后取出EP管，300g離心5min，去除上清，再加入1 mL DMEM/F12（含1% BSA），吹打孔中混合物40-50次，使類器官團徹底解離成單細胞，離心，去上清；
（6）用預冷槍頭按每孔30 μL的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8次，均勻混合單細胞-基質(zhì)膠，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡；
（7）將提前放在培養(yǎng)箱中的24孔板取出，在孔中心位置加入30 μL膠滴，緩慢打入混合液時，逐漸向上移動槍頭，使細胞均勻分布在膠中；
（8）將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固；
（9）小心沿孔壁加入700 μL恢復室溫的3D肝類器官培養(yǎng)基，注意不要碰到膠滴；
（10）將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1天換液一次（可周一、周三、周五換液，周五可添加至800 μL，周六、周日不換液），1周左右傳代一次。

流程圖及參考圖片