產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品為iPSC誘導分化腎類器官試劑盒，人誘導多能干細胞hiPSC通過該試劑盒誘導分化可得到腎類器官，該類器官具類似腎的細胞組成，有腎小球、腎小管上皮細胞等。
本試劑盒需要操作人員具有hiPSC培養(yǎng)經(jīng)驗，對類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導分化腎類器官試劑盒

實驗儀器、材料

儀器：生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱
材料：6孔細胞培養(yǎng)板、超低吸附96孔板、離心管（規(guī)格為15 mL 和 50 mL）、移液器（規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL和多通道100 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（規(guī)格為10 mL、50 mL）

操作步驟

一、EB形成（2天）
1. hiPSC于VTN包被的六孔板的一個孔生長至70-80%匯合度。
2. 吸去培養(yǎng)基。
3. 孔中加入1 mL PBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
4. 孔中加入1 mL Tryple express，37℃消化5min。
5. 于兩只15 mL 離心管中分別加入10 mL EB形成培養(yǎng)基，并補充10 uM Y27632。（注意：所用培養(yǎng)基均應提前在工作臺放置30min以恢復室溫，后面操作同理。）
6. 消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發(fā)白發(fā)亮。
7. 吸去Tryple express，每孔加入1 mL EB形成培養(yǎng)基終止消化。
8. 輕輕吹打孔內細胞2-3次，將細胞懸液移至有9 mL EB形成培養(yǎng)基的15 mL離心管中。
9. 100g離心5min，吸棄上清。
10. 向細胞沉淀加入10 mL 步驟5獲得含Y27632的EB形成培養(yǎng)基，重新制成細胞懸液。
11. 將細胞懸液移至加樣槽，使用多通道移液器種到超低吸附96板中，每孔100 μL，接種96個孔，普通96孔板每孔加100 μL PBS，96孔作為配平。
12. 于低速水平離心機，850rpm/120g離心3min，將板放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，記為D-2。
13. 第2天(D-1）可以看到形成大小均一的EB。每孔補充100 μL不含Y27632的EB形成培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。
（注意：補充EB形成培養(yǎng)基后，可將多通道移液器槍頭置于液面下輕輕吹打，在不影響到EB的情況下混勻培養(yǎng)基。）
二、后原始條紋誘導（4天）
14. D0，解凍補充劑A，將基礎培養(yǎng)基1與補充劑A混勻，作為后原始條紋誘導培養(yǎng)基。
15. 準備15 mL離心管，使用100 μL移液槍將孔中原培養(yǎng)基吸出放至離心管中。
16. 取出10 mL配好的后原始條紋誘導培養(yǎng)基，使用移液器移至加樣槽中，使用多通道移液器，每孔加100 μL后原始條紋誘導培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
（注意：吸去培養(yǎng)基時廢液泵吸力過大，往往會將EB一并吸走，故采用100 μL移液槍逐孔吸取廢液。）
17. D2更換后原始條紋誘導培養(yǎng)基，操作如15、16。
三、中間中胚層誘導（3天）
18. D4，解凍補充劑B，將基礎培養(yǎng)基2與補充劑B混勻，作為中間中胚層誘導培養(yǎng)基。更換中間中胚層誘導培養(yǎng)基，操作如15、16。
19. D6更換中間中胚層誘導培養(yǎng)基，操作如15、16。
四、腎發(fā)生（5天）
20. D7，解凍補充劑C、D，將10 mL基礎培養(yǎng)基3與補充劑C混勻，作為腎發(fā)生培養(yǎng)基1。更換腎發(fā)生培養(yǎng)基1，操作如15、16，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時。
21. 1小時后，將30 mL基礎培養(yǎng)基3與補充劑D混勻，作為腎發(fā)生培養(yǎng)基2。更換腎發(fā)生培養(yǎng)基2，操作如15、16。
22. D9、D11，更換腎發(fā)生培養(yǎng)基2，操作如15、16。
四、腎類器官成熟（11天）
23. D12開始，每2天更換成熟培養(yǎng)基，操作如15、16，至D23。

流程圖及參考圖片