產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品為iPSC誘導(dǎo)分化內(nèi)耳類器官試劑盒，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞hiPSC通過該試劑盒誘導(dǎo)分化可得到內(nèi)耳類器官，該類器官具類似內(nèi)耳的細(xì)胞組成，生長(zhǎng)過程中有分化出耳泡結(jié)構(gòu)及毛細(xì)胞。
本試劑盒需要操作人員具有hiPSC培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進(jìn)一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導(dǎo)分化內(nèi)耳類器官試劑盒

實(shí)驗(yàn)儀器、材料

儀器：生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱、水平式離心機(jī)、倒置顯微鏡、低溫冰箱
材料：6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、超低吸附96孔板、離心管（規(guī)格為15 mL 和 50 mL）、移液器（規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL 和多通道100 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（規(guī)格為10 mL、50 mL）。

操作步驟

一、EB形成（2天）
1. hiPSC于VTN包被的六孔板的一個(gè)孔生長(zhǎng)至70-80%匯合度。
2. 吸去培養(yǎng)基。
3. 孔中加入1mL PBS（無鈣鎂離子）洗，吸去。
4. 孔中加入1mLTryple express，37℃消化5min。
5. 于兩只15mL 離心管中分別加入10ml EB形成培養(yǎng)基，并補(bǔ)充10 uM Y27632。（注意：所用培養(yǎng)基均應(yīng)提前在工作 臺(tái)放置30min以恢復(fù)室溫，后面操作同理。）
6. 消化完成后于顯微鏡下可看到克隆發(fā)白發(fā)亮。
7. 吸去Tryple express，每孔加入1ml EB形成培養(yǎng)基終止消化。
8. 輕輕吹打孔內(nèi)細(xì)胞2-3次，將細(xì)胞懸液移至有9ml EB形成培養(yǎng)基的15ml離心管中。
9. 100g離心5min，吸棄上清。
10. 向細(xì)胞沉淀加入10 mL步驟5獲得含Y27632的EB形成培養(yǎng)基，重新制成細(xì)胞懸液。
11. 將細(xì)胞懸液移至加樣槽，使用多通道移液器種到超低吸附96板中，每孔100 μL，接種96個(gè)孔，普通96孔板每孔加100 μL PBS，96孔作為配平。
12. 于低速水平離心機(jī)，850rpm/120g離心3min，將板放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，記為D-2。
13. 第2天(D-1）可以看到形成大小均一的EB。每孔補(bǔ)充100 μL不含Y27632的EB形成培養(yǎng)基，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。
（注意：補(bǔ)充EB形成培養(yǎng)基后，可將多通道移液器槍頭置于液面下輕輕吹打，在不影響到EB的情況下混勻培養(yǎng)基。）二、EB分化階段（12天）
14. D0，解凍補(bǔ)充劑A，吸棄培養(yǎng)基，9.6 mL預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1與補(bǔ)充劑A、200 μL Matrigel混合均勻，恢復(fù)至室溫后，按每孔100 μL，加到96孔板中，誘導(dǎo)EB分化，用多通道移液器輕輕吹打，使EB懸浮。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
15. D4，解凍補(bǔ)充劑B，2.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+補(bǔ)充劑B混合均勻，按每孔25 μL，加到96孔板中，并輕輕移液8-10次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為125 μL，將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2培養(yǎng)4天。
16. D8，解凍補(bǔ)充劑C，2.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+補(bǔ)充劑C混合均勻，按每孔25 μL，加到96孔板中，并輕輕移液8-10次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為150 μL，將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2培養(yǎng)4天。
三、耳泡形成階段（6天）
17. D12，EB誘導(dǎo)結(jié)束，準(zhǔn)備好基礎(chǔ)培養(yǎng)基2（提前在冰上冷藏至少30min）；或者，在d11上使基礎(chǔ)培養(yǎng)基2存儲(chǔ)在4°C過夜。Matrigel提前與補(bǔ)充劑D于4℃解凍，冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2與補(bǔ)充劑D混合均勻。將200 μL Matrigel加入20 mL冷的混合培養(yǎng)基中，反復(fù)吹打溶解20次，復(fù)溫到室溫。將96孔板中的聚集物轉(zhuǎn)移到兩個(gè)100mm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中有48個(gè)聚集體。用1-2 mL的DPBS洗滌聚集體2次，再用1 mL不含Matrigel的混合培養(yǎng)基洗滌1次，然后分別加入10 mL含Matrigel的混合培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2 培養(yǎng)3天；D15吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，重新加入不含Matrigel的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，誘導(dǎo)耳泡形成；
（注意：10 mm皿一般換液需要10 mL培養(yǎng)基）
四、內(nèi)耳類器官成熟階段（42天）
18，D18-60，內(nèi)耳類器官逐漸成熟，將培養(yǎng)基換成成熟培養(yǎng)基，開始長(zhǎng)期培養(yǎng)，每5天換一次液，到60天左右獲得具有感覺毛細(xì)胞的成熟內(nèi)耳類器官。

流程圖及參考圖片