產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品iHLOs 為 hiPSC誘導(dǎo)分化肺類器官，該類器官由類似肺泡的細胞組成，成熟后的類器官有氣道細胞、肺泡細胞。在體外培養(yǎng)條件下可維持60天，并穩(wěn)定傳代擴增、凍存和復(fù)蘇。
本產(chǎn)品需要操作人員具有細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，對類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導(dǎo)分化肝類器官iHHOs

實驗儀器、材料

儀器：生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱、恒溫水浴鍋。
材料：24孔細胞培養(yǎng)板、離心管（規(guī)格為15 mL 和 50 mL）、移液器（規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（規(guī)格為10mL、50mL）。

鑒定結(jié)果

操作步驟

一、iHLOs復(fù)蘇
1. 基質(zhì)膠在4℃下解凍，恒溫水浴鍋37℃預(yù)熱，100 μL槍頭于-20℃預(yù)冷，199.48 mL iHLOs基礎(chǔ)培養(yǎng)基與520 μL  iHLOs培養(yǎng)補充劑混勻制備iHLOs完全培養(yǎng)基。（ 注意：配制iHLOs完全培養(yǎng)基需在2周內(nèi)用完，可將iHLOs培養(yǎng)補充劑分裝凍存，根據(jù)實驗需要配制iHLOs完全培養(yǎng)基，避免反復(fù)凍融 ）。
2. 將含hiPSC誘導(dǎo)分化肺類器官 iHLOs的凍存管從液氮罐中取出，在37℃水浴鍋中快速解凍，當剩少許浮冰時，取出，酒精消毒，轉(zhuǎn)移到生物安全柜中。
3. 將解凍好的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15離心管中，緩慢加入9 mL復(fù)溫的DMEM/F12（含10μM Y27632），150g離心5min。 
4. 去上清，加入30 μL基質(zhì)膠，均勻混合基質(zhì)膠-單細胞，用預(yù)冷槍頭將30 μL基質(zhì)膠加到孔中心，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固。
5. 取出培養(yǎng)板，小心沿孔壁加入恢復(fù)室溫的700μL iHLOs完全培養(yǎng)基，注意不要碰到膠滴。注意：所用試劑除標注“預(yù)冷”外，在使用前均需恢復(fù)至室溫。
6. 將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天更換iHLOs完全培養(yǎng)基，每7-10天傳代。
二、iHLOs傳代
1. 取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預(yù)冷1h。
2. 吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的Tryple（含1%BSA），靜置1 min。
3. 使用1 mL移液槍，吹打孔中混合物40-50次。注意：不要產(chǎn)生氣泡。
4. 每孔加入1 mL預(yù)冷的PBS（含1%BSA），將混合物轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中；
5. 用1 mL預(yù)冷的PBS（含1%BSA）清洗培養(yǎng)板，并將該清洗液加入上一步的離心管中，并補充預(yù)冷的PBS（含1%BSA），使離心管中的終體積為12 mL； 300 g離心5min，去上清。
6. 用預(yù)冷槍頭按每孔30 μL的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8次，均勻混合單細胞-基質(zhì)膠，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡。
7. 在24孔板孔中心位置加入30 μL膠滴，緩慢打入混合液時，逐漸向上移動槍頭，使細胞均勻分布在膠中。
8. 將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min，使膠滴凝固。
9. 小心沿孔壁加入700 μL恢復(fù)室溫的iHLOs完全培養(yǎng)基，每隔1天換液一次（可周一、周三、周五換液，周五可添加至800 μL，周六、周日不換液），注意不要碰到膠滴，將孔板放到培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)。
三、 iHLOs凍存
1. 將程序降溫盒放在-20℃中預(yù)冷1h。
2. 吸除培養(yǎng)基，加入1 mL預(yù)冷的Tryple（含1%BSA），靜置1min。
3. 使用1 mL移液槍，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要產(chǎn)生氣泡。
4. 每孔加入1 mL預(yù)冷的DMEM/F12（含1%BSA），將混合物轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中。
5. 用1 mL預(yù)冷的DMEM/F12（含1%BSA）清洗培養(yǎng)板，并將該清洗液加入上一步的離心管中，并補充預(yù)冷的DMEM/F12（含1%BSA），使離心管中的終體積為12 mL。
6. 300 g離心5min，去上清。
7. 加入1 mL預(yù)冷的類器官凍存液（含10 μM Y27632），重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到凍存管中。
8. 將凍存管放到提前預(yù)冷的降溫盒中，將降溫盒轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，過夜；隔天將降溫盒里的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中，長期保存。