產(chǎn)品介紹

本產(chǎn)品為iPSC誘導分化心臟類器官試劑盒，人誘導多能干細胞hiPSC通過該試劑盒誘導分化可得到心臟類器官，該類器官由心肌細胞、心外膜細胞等細胞組成，成熟后的類器官有腔室結(jié)構(gòu)，具有早期搏動功能。 本試劑盒需要操作人員具有hiPSC培養(yǎng)經(jīng)驗，對類器官具有一定了解。
注意：本產(chǎn)品僅提供給進一步科研使用，不可用于臨床治療等其他用途。

hiPSC誘導分化心臟類器官試劑盒

實驗儀器、材料

儀器：生物安全柜、細胞培養(yǎng)箱、水平式離心機、倒置顯微鏡、低溫冰箱
材料：細胞培養(yǎng)板（規(guī)格為：96孔）、離心管（規(guī)格為15 mL、50 mL）、移液器（規(guī)格為 10 μL、100 μL、1000 μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10 μL、200 μL 和 1000 μL）、移液管（規(guī)格為10 mL、50 mL）

操作步驟

Ⅰ階段（D0-2）（按1個96孔板，每孔100 μL算）
（1）當hiPSC的匯合度達到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2 mL 1x室溫PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗hiPSC，吸去PBS。
（2）加入1 mL含Y-27632（10 μM）的室溫EDTA，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中5 min。
（3）5 min后，將干細胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入EDTA中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min。
（4）離心結(jié)束，充分去除上清，將1 mL預(yù)熱的干細胞培養(yǎng)基（含10 μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
（5）使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞，按每孔5000個細胞的比例將所需細胞收集到離心管中，將10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1與20μL補充劑A充分混合，并加入到離心管中，將細胞吹打均勻，然后按每孔100μL的體積將細胞懸液接種到96孔板中，1000 rpm離心5min，然后將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24h。
（6）在第1天和第2天，吸去培養(yǎng)基，加入10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1使細胞形成EB。
Ⅱ階段（D3-4）
第3天，將9.94 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基2與60 μL補充劑B充分混勻，配置成Ⅱ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100 μL的體積將Ⅱ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。
Ⅲ階段（D5-6）
第5天，將9.98 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基3與20 μL補充劑C充分混勻，配置成Ⅲ階段培養(yǎng)基，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100 μL的體積將Ⅲ階段培養(yǎng)基加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)2天。
Ⅳ階段（D7-21）
（1）第7天，從孔中抽吸培養(yǎng)基，按每孔100 μL的體積將基礎(chǔ)培養(yǎng)基4加入孔中，將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，開始長期培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)基。
（2）心臟類器官將在分化后的10-13天開始跳動，進一步培養(yǎng)后第19-21天取樣鑒定。

流程圖及參考圖片