一、產(chǎn)品簡介

hiPSC-CAS9細胞株是將含Cas9蛋白基因的載體轉(zhuǎn)染進hiPSC細胞中，通過藥物篩選，得到長期穩(wěn)定表達的hiPSC-CAS9穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。貼壁生長，呈克隆狀，半藥濃度H=50ug/ml，可在hESC/iPSC完全培養(yǎng)基中快速增殖。包裝規(guī)格為1mL凍存管，含量為>1x106個/mL，且支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性。

hiPSC-CAS9細胞株穩(wěn)定表達Cas9核酸酶，通過轉(zhuǎn)染 gRNA可實現(xiàn)基因敲除，轉(zhuǎn)染 gRNA 和供體 DNA，可實現(xiàn)基因敲入/點突變。細胞系在體外長期培養(yǎng)可能導(dǎo)致部分細胞基因組發(fā)生改變，可能會降低 Cas9 的表達。因此，我們提供低代次(10 代以內(nèi))的細胞，保證實驗效果。

為了維持 Cas9 基因表達量的穩(wěn)定，建議傳代時使用半藥培養(yǎng)。

二、試劑準備

1)hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配制(500 mL)

1. 在4℃條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，之后置于4℃儲存，封口膜封好后2周內(nèi)使用。

3. 有初培養(yǎng)需擴建的需求，建議先配置100 mL,保證2周內(nèi)使用完畢。

表 1：hESC/iPSC完全培養(yǎng)基配置說明

可根據(jù)實際用量將hESC/iPSC Grouth Supplements A/B分裝后冷凍保存。具體配置比例可參考表3的配置說明。 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B凍融總次數(shù)不能超過2次。

2)Matrigel鋪板(以貨號為354277的Corning? Matrigel?包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數(shù)量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時。

3. 將Matrigel放置4℃冰箱過夜解凍，當Matrigel完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel(278μL)置于4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預(yù)冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷吸頭向解凍過的Matrigel(278μL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復(fù)吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫1小時后即可使用，或置于4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

三、細胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預(yù)熱至37℃;并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(15~30℃)。

3. 取2 mL hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度為10uM，恢復(fù)至室溫(15~30℃)。

注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

4. 取出1支冷凍的細胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時取出。

5. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜;將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。 6. 吸棄上清，加入預(yù)溫的2 mL的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

7. 吸除6孔板中1孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。

8. 水平十字搖勻三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻三次培養(yǎng)。

9. 18-24小時后換新的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

注：在hiPSC培養(yǎng)過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養(yǎng)基時，培養(yǎng)基的體積增加至3-4mL/孔。

表2：hESC/iPSC傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

2)傳代hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 傳代條件：① 細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② 細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天。

1. 傳代比例：可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25℃)。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準備2 mL/孔的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C終濃度為10uM，恢復(fù)至室溫(~25℃)。

5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復(fù)至室溫(~25℃)。

6. 將孔內(nèi)培養(yǎng)基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。

7. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆蓋孔底。

8. 置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5-6 min。

注：① 消化5-6 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；② 保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

圖1. hESC/iPSC完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)hiPSC-CAS9 細胞形態(tài)圖：(A)和(B)分別為hiPSC-CAS9細胞培養(yǎng)第2和4天時低倍鏡hiPSC培養(yǎng)形態(tài)圖示，(C)和(D)為培養(yǎng)至第2和4天時的高倍鏡hiPSC-CAS9培養(yǎng)形態(tài)圖。

9. 消化結(jié)束后輕輕地將細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

10. 及時加入2 mL/孔預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)。

注：① 加hESC/iPSC完全培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復(fù)吹打;有部分細胞(10%～15%)未脫離基質(zhì)是正?，F(xiàn)象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間(< 10min)。

圖2：消化hiPSC細胞不同時間形態(tài)圖：(A)消化5 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖;(B)消化6 min低倍鏡hiPSC培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

② hiPSC細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板)。

11. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預(yù)溫的hESC/iPSC完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

12. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預(yù)先設(shè)定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟8獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次;再按照傳代比例接種。

13. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養(yǎng)過夜。

14. 18-24小時后更換新hESC/iPSC完全培養(yǎng)基，此后每天換液，4-5天后繼續(xù)傳代/凍存。

3)凍存hESC/iPSC(以6孔板為例)

1. 當細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準備相應(yīng)數(shù)量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，計時5-6 min(可參考“六、傳代hESC/iPSC”步驟)。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

四、收貨注意事項

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，干冰運輸?shù)募毎麢z查干冰是否完全揮發(fā)，細胞是否解凍，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關(guān)信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

4. 建議客戶復(fù)蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

5. 該細胞僅供科研使用。